AT1R偏向性途径对嗜铬细胞儿茶酚胺分泌的影响及机制

发布时间：2018-02-26 09:21

  本文关键词： GPCR AT1R TRPC3 β-arrestin TRV120027 Pyr3 儿茶酚胺 嗜铬细胞 安培法 Ca~(2+) TRP通道 GPCR 偏向性配体 钙成像 TRV120027 儿茶酚胺嗜铬细胞 安培法　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:血管紧张素Ⅰ型受体(Angiotensin receptor 1 receptor,ATlR)偏向性配体通过激活(;蛋白白依赖的或β-拘禁蛋白依赖的途径产生不同的效应。最近的研究结果表明,针对AT1R-拘禁蛋白偏向性途径的配体对治疗心衰,要比氯沙坦具有更好的疗效。但是血管紧张素通过其受体刺激肾上腺髓质后产生的肾上腺素和去甲肾上腺素对某些心血管疾病是不利的。目前AT1R-拘禁蛋白偏向性配体-TRV120027已进入三期临床,所以本实验主要研究拘禁蛋白介导的AT1R信号途径是否影响肾上腺嗜铬细胞儿茶酚胺的分泌及其机制。方法:在本研究中,我们分离雌性小鼠的原代肾上腺嗜铬细胞(Mouse Adrenal Chromaffin Cells,MACC),使用特异的G蛋白向性或β-拘禁蛋白偏向性ATlR激动剂研究不同偏向性信号通路对肾上腺髓质嗜铬细胞分泌的影响及分子机制。我们通过电化学方法和酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immuosorbent assay,ELISA)检查临床前药物TRV120027对儿茶酚胺分泌的影响,并应用信号通路中小分子抑制剂,野生型或β-arrestin-1、β-arrest in-2、Gq或TRPC3-敲除小鼠,检测TRV120027刺激儿茶酚胺分泌的分子机制。结果:1.Gq偏向性配体引起MACC分泌ATlR的Gq偏向性配体TRV120055和TRV120056能引起小鼠肾上腺嗜铬细胞,儿茶酚胺的量子化释放,并且Gq偏向性激动剂(TRV120055,TRV120056)引起的分泌量只占全激动剂AngⅡ引起儿茶酚胺分泌量的一半。2.β-拘禁蛋白偏向性配体引起MACC分泌AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体SII、TRV120026和TRV120027能引起小鼠肾上腺嗜铬细胞儿茶酚胺分泌。并且分析发现β-拘禁蛋白偏向性激动剂(SII、TRV120027和TRV120026)引起的分泌量只占全激动剂AngⅡ引起儿茶酚胺分泌量的一半。同时TRV120027引起的分泌能被AT1R的拮抗剂坎地沙坦(100nM)完全阻断。3.ELISA检测ATlR不同偏向性配体引起的MACC分泌在分离的完整小鼠肾上腺髓质上,给予配体刺激1min,用ELISA试剂盒分别检测AT1R的不同偏向性配体引起髓质分泌肾上腺素(Epinephrine,E)和去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)的情况。AT1R的完全激动剂Ang Ⅱ、Gq偏向性配体(TRV120055)和β-拘禁蛋白偏向性配体(SII和TRV120027)短时间刺激1 min均可引起髓质E和NE分泌增多。4.Gq偏向性配体引起MACC的分泌可被U73122阻断在分离的MACC上,PLC的阻断剂U73I22(10 μMM)抑制ATlR的全激动剂AngⅡ引起的儿茶酚胺分泌,其分泌量降低约有一半;而ATlR的Gq偏向性激动剂TRV120055和TRV120056引起MACC分泌后,再给予U73122后,无法检测到儿茶酚胺的分泌,说明U73122完全阻断了ATlR的Gq偏向性激动剂引起的MACC的分泌。5.β-拘禁蛋白偏向性配体引起MACC的分泌不能被U73122阻断在培养的单个的MACC上,分别给予ATlR的β-拘禁蛋白偏向性配体SII、TRV120027或TRV120026,检测MACC儿茶酚胺分泌,给10μM U73122阻断6min后,再给AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体后,儿茶酚胺分泌量并未下降。因此,AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体引起的MACC分泌不能被U73122阻断。6.TRV120027引起的MACC儿茶酚胺分泌非Gq途径在分离培养的Gq-基因敲除小鼠肾上腺嗜铬细胞上,给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027,可引起Gq敲除的MACC儿茶酚胺分泌,同时比较Gq敲除的和野生的MACC的儿茶酚胺释放量无明显差异,进一步证实TRV120027引起的MACC儿茶酚胺分泌不需要激活Gq途径,是非Gq依赖的。7.TRV120027引起的MACC儿茶酚胺分泌非Gi途径实验中选择Gi的抑制剂百日咳毒素(pertussis toxin,PTX),用1μM PTX预孵育嗜铬细胞后,再给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027,仍可检测到MACC儿茶酚胺分泌,同时比较加入PTX的和未加入PTX孵育的MACC儿茶酚胺释放量无明显差异,提示TRV120027引起的MACC儿茶酚胺分泌是非Gi依赖的。8.β-arrestin-1介导TRV120027引起MACC的儿茶酚胺分泌实验中分离培养β-arrestin-2基因敲除小鼠的嗜铬细胞,给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027,嗜铬细胞分泌良好,比较β-arrestin-2-/-敲除的和野生型(Wild type,WT)的MACC的儿茶酚胺释放量无明显差异。由结果可知,β-arrestin-2-敲除不影响TRV120027引起MACC的儿茶酚胺分泌。然而,同样分离培养β-arrestin-1-基因敲除小鼠的嗜铬细胞,给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027后,却未引起嗜铬细胞儿茶酚胺的量子化释放,比较β-arrestin-1敲除的和WT的MACC的儿茶酚胺释放量差异非常显著。由结果可知β-arrestin-1介导了 TRV120027引起MACC的儿茶酚胺分泌。9.TRV120027引起MACC儿茶酚胺的分泌依赖于细胞外钙离子实验中使MACC在标准含钙离子溶液和无钙离子的外液之间进行切换的方法,当给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体SII和TRV120027 后,在标准含钙离子溶液可引起MACC的分泌;而切换到无钙离子的外液时,SII和TRV120027均未引起MACC儿茶酚胺的分泌,由此可知TRV120027引起MACC儿茶酚胺的分泌依赖于细胞外的钙离子。10.TRPC3敲除后,影响TRV120027引起MACC儿茶酚胺的分泌实验中分别分离培养TRPC3 TRPC6 TRPC7和TRPC3 TRPC6 TRPC7基因敲除小鼠的嗜铬细胞,当给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027后,可引起TRPC3+-TRPC6 TRPC7-的MACC儿茶酚胺的分泌却口不能引起TRPC3 TRPC6 TRPC7-的MACC儿茶酚胺的分泌,二者儿茶酚胺释放量差异非常显著(p0.005)。当实验中分离培养只敲除TRPC3基因的小鼠的嗜铬细胞,给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027后,也未引起MACC儿茶酚胺的量子化释放,比较TRPC3-敲除的和WT的MACC的儿茶酚胺释放量差异非常显著(p0.005),以上结果证实AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027激活TRPC3通道导致钙内流引起MACC的儿茶酚胺分泌。11.β-arrestin-1-TRPC3途径在是不同GPCR激动剂诱导分泌中的一般通路。实验中选用不同G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)激动剂激动剂,包括氯化乙酰甲胆碱(Methacholine Chloride,Mch)、硫酸化八肽胆囊收缩素(sulfated cholecystokininoctapeptide,CCK-8s)和缩宫素(Oxytocin 0T),激活MACC上的相应受体后均引起儿茶酚胺的分泌。而且0T和CCK-8s引起的MACC儿茶酚胺的分泌被U73122阻断后,分泌量分别降为80%和50%。当同时应用TRPC3通道阻断剂Pyr3和PLC阻断剂U73122后,0T-或CCK-8s引起的MACC儿茶酚胺的分泌量与单独用U73122后MACC儿茶酚胺的分泌量无明显差异,表明TRPC3在活化胆囊收缩素受体或缩宫素受体后不参与除Gq-PLCβ通路外的儿茶酚胺分泌。与此不同的是,虽然U73122将Mch诱导MACC儿茶酚胺的分泌量降低了 50%,但是Pyr3和U73122的组合使用进一步使Mch引起MACC的儿茶酚胺分泌量进一步降低至约15%,这表明在嗜铬细胞中乙酰胆碱受体介导的MACC的儿茶酚胺分泌也是基于激活TRPC3而产生的。同样的,实验中分离培养β-arrestin-1-/-基因敲除小鼠的嗜铬细胞,给予Mch引起儿茶酚胺分泌,与WT小鼠儿茶酚胺分泌量比较,在β-arrestin-1-/-敲除的MACC中显著降低。在WT小鼠中,U73122的应用虽降低了 Mch诱导的儿茶酚胺分泌量约40%,而在Mch诱导β-arrestin-1-/-敲除的MACC的儿茶酚胺分泌减少了近80%。因此,β-arestin-1-TRPC3途径是介导原代嗜铬细胞中Mch诱导的儿茶酚胺分泌的有效活性成分。讨论:这项工作揭示了除了经典的G蛋白-TRP通道轴,β-arrestin-1也可以介导急性生理过程,通过直接结合并由此激活TRPC3通道。尤其在GPCR信号和拘禁蛋白功能领域,AT1R-β-arrestin-1-TRPC3分泌模式是一种新的GPCR激活方式。综合起来看,本研究有助于阐明GPCR是如何调节离子通道活动的,并为临床上治疗心力衰竭指明了一个新的方向。对人类在某些生理和病理条件,阐明细胞对环境刺激产生的不同反应也将产生广泛的影响。结论:1.AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体可引起MACC儿茶酚胺的量子化释放。2.AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体引起MACC儿茶酚胺的量子化释放是由β-arrestin-1 介导的。3.AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体引起MACC儿茶酚胺的量子化释放主要通过细胞外的钙离子内流而实现。4.TRV120027激活TRPC3通道引起钙内流导致儿茶酚胺分泌。5.β-arrestin-1介导的AT1R与TRPC3的偶联是一种新的GPCR激活的方式。目的:几乎所有的生命活动过程都受到Ca~(2+)的调控。Ca~(2+)作为胞内第二信使,在细胞内调节包括分泌在内的各种生理过程。钙离子在调控分泌中的核心作用得到确立。在囊泡出胞的过程中,Ca~(2+)更是触发最后融合的关键因子。据我们前述的研究结果,β-拘禁蛋白偏向性配体刺激小鼠肾上腺嗜铬细胞引起的儿茶酚胺释放主要通过细胞外的钙离子内流而实现的,本实验研究钙通道在β-拘禁蛋白偏向性配体引起的钙离子变化中的作用。方法:本研究主要应用钙成像记录法以明确证明AT1R拘禁蛋白介导的儿茶酚胺分泌胞内钙离子的变化及机制,并应用小分子抑制剂、通道阻断剂和β-arrestin-1、β-arrestin-2、TRPC3敲除小鼠的原代嗜铬细胞内钙的变化加以证实。并用293细胞进行AT1R,β-arrestin-1和TRPC3共表达实验,以验证TRV120027作用于AT1R,β-arrestin-1和TRPC3在细胞膜上的共定位情况。结果:1.β 拘禁蛋白偏向性配体引起MACC内的[Ca~(2+)]增加不能被U73122阻断本研究中首先选用AT1R全激动剂AngⅡ作用于嗜铬细胞1min使F340/380比值升高,细胞内[Ca~(2+)]_i升高,U73122阻断后,再用AngⅡ后MACC的F340/380比值升高降低了约50%。在β-arrestin-2基因敲除的小鼠中得到了相同的结果。而且在β-arrestin-2-基因敲除小鼠的嗜铬细胞,AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027引起MACC的F340/380的比值仍然升高约0.4,进一步说明β-arrestin-2不能介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca~(2+)]的升高变化。但是β-arrestin-2基因敲除比较WT小鼠嗜铬细胞内[Ca~(2+)],的比值升高更明显(p0.05)。而高KC1导致的β-arrestin-2 i基因敲除小鼠嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i升高,和WT小鼠嗜铬细胞[Ca~(2+)]_i升高变化不明显,说明β-arrestin-2敲除不影响高KC1对MACC的分泌效应,这与第一部分结果中对嗜铬细胞分泌的影响一致。2.β-arrestin-1介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i变化本实验中首先用AT1R的全激动剂AngⅡ作用于β-arrestin-1敲除的嗜铬细胞后F340/380比值升高,细胞内[Ca~(2+)]_i升高,用U73122 阻断后,再用AngⅡ作用MACC后,嗜铬细胞的F340/380比值未见升高,比较分析差异非常显著(p0.005)。其次,选用AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027作用于β-arrestin-1-敲除的嗜铬细胞1min后F340/380比值未发生变化,即嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i,未发生变化。由此得到结果,β-arrestin-1介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i变化。3.细胞外Ca~(2+)对TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i变化的影响AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体SII和TRV120027 在无钙溶液中作用于MACC后F340/380比值不变,没有记录到[Ca~(2+)]_i升高变化,与在标准钙溶液中记录到的F340/380比值升高比较分析差异非常显著(p0.01)。高KC1作用于MACC后F340/380比值升高约1.5以上,使[Ca~(2+)]_i,升高,当切换到无钙离子的外液时,也未出现F340/380比值的变化,胞内[Ca~(2+)]_i未升高,两者分析比较差异极显著(p0.005)。由此证实,AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体作用于MACC后,使细胞外的Ca~(2+)内流,致使细胞内[Ca~(2+)]_i升高。4.TRP通道介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i变化实验中选择不同钙通道阻断剂,L型钙通道阻断剂尼卡地平、R型钙通道阻断剂SNX482和电压门控性钙通道阻断剂CdCl2,阻断相应通道后,用AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027作用于MACC,仍可记录到F34/F380比值升高,通过分析比较各阻断剂的抑制率没有发现显著差异,证实尼卡地平、SNX482和CdCl2未阻断钙内流。最后选择非特异性TRP通道阻断剂钉红(Ruthenium Red,RR),阻断TRP通道后,再给TRV120027作用于MACC,却未出现F340/K380比值的升高,嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i未发生变化,说明RR明显的抑制了TRV120027引起的钙离子变化,钙内流被阻断,即TRP通道介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i变化。5.TRPC3介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i变化实验中选择不同TRP通道阻断剂,检测AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027作用于MACC后胞内[Ca2]i的变化,以确定哪种TRP通道起作用。当用TRPV4特异性阻断剂HC067047和TRPC4特异性阻断剂ML-204阻断相应通道后,TRV120027作用于MACC,仍记录到F340/F380比值升高,通过分析比较各阻断剂的抑制率没有发现显著差异,HC067047和ML-204未阻断TRV120027引起的MACC的钙内流。选用非特异性TRPC3/6/7阻断剂氧化镧后,再给TRV120027作用于MACC,并未出现F340/F380比值的升高,说明氧化镧明显的抑制了TRV120027引起的钙离子变化,钙内流被阻断;应用特异性TRPC3通道阻断剂Pyr3后,TRV120027作用于MACC引起的钙内流也被阻断。以上结果可知,TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i增加是由TRPC3通道介导的。6.TRPC3,β-arrestin-1和AT1R共表达把TRPC3-GFP和β-arrestin-1-RFP共转染293细胞,100nM Ang Ⅱ和100nMTRV20007刺激后β-arrestin-1-RFP 上膜,Merge后与TRPC3共定位在细胞膜上。把TRPC3-GFP和AT1R-cherry共转染293细胞,100nM Ang Ⅱ和100nM TRV120027刺激后AT1R受体上膜,Merge后与TRPC3共定位在细胞膜上。证实了TRV120027刺激AT1R-arrestin1后迅速偶联激活TRPC3通道。讨论:我们的结果表明,AT1R招募了β-arrestin-1到质膜并以快速促进形成的AT1R-arrestin-1-TRPC3复合物的方式,从而导致TRPC3通道的直接开放,介导细胞外Ca~(2+)流入并触发儿茶酚胺分泌。本研究阐明了GPCR信号传导和抑制功能的新范例。β-arrestin介导的AT1R与TRPC3的偶联是一种新的GPCR激活的方式。结论:1.β-arrestin-1介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i变化。2.TRPC3介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca~(2+)]_i变化。3.β-arrestin-1介导的AT1R与TRPC3的偶联是一种新的GPCR激活方式。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R363
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本文编号：1537420