共刺激分子OX40调控双阴性T细胞转化及存活的机制研究

发布时间：2018-03-03 05:00

  本文选题：5-乙炔基-2’脱氧尿苷　切入点：细胞增殖　出处：《首都医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:5-乙炔基-2’脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)是一种新型有效的细胞增殖检测方法,而流式细胞术能够进行多重染色,可同时分析多种淋巴细胞亚群,在进行淋巴细胞检测时更有优势。本研究旨在建立EdU掺入法用于T淋巴细胞体内增殖的方法,优化流式细胞术检测EdU染色过程,并评估EdU检测体内淋巴细胞增殖的有效性。方法:首先将C57BL/6小鼠来源脾细胞进行体外染色、固定、透膜及EdU染色,明确EdU染色过程中4%多聚甲醛固定剂,皂素和Triton X-100透膜剂,以及Click反应过程对常见淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD19、CD25抗原完整性及不同荧光标记抗体荧光强度的影响,优化EdU染色过程,并对比皂素和Triton X-100透膜剂对EdU阳性率的影响;然后通过向B6D2F1小鼠尾静脉注射CD45.1阳性C57BL/6小鼠来源脾细胞建立过继性转移淋巴细胞体内增殖模型,比较不同方式(尾静脉、腹腔注射)、不同剂量(0-30 mg/kg)EdU之间淋巴细胞增殖率差异,从而优化检测体内淋巴细胞增殖时EdU使用方法。此外也对优化的EdU掺入法与5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)及羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)用于体内淋巴细胞增殖检测时的效能进行了比较研究。最后通过优化的EdU掺入方法检测体内固有胸腺细胞及骨髓细胞的增殖。结果:脾细胞表面染色后经适当固定、透膜可以保护CD3+T细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞表面抗原的完整性,并对APC、PE、PE-Cy7、FITC和Per CP-Cy5.5荧光强度无明显影响;Click反应可使PE、PE-Cy7荧光强度明显下降,PE、PECy7偶联抗体可在Click反应后进行表面染色,染色前使用3%FBS室温孵育封闭30 min可有效降低淋巴细胞的假阳性率;尾静脉与腹腔注射EdU,检测到淋巴细胞增殖率无明显差别(P0.05);淋巴细胞增殖率呈EdU剂量依赖式增加,当剂量增加至20 mg/kg时,增殖率达到饱和;EdU掺入法检测淋巴细胞增殖率与BrdU法无明显差异,但均低于CFSE。在检测体内固有淋巴细胞增殖时,胸腺细胞及骨髓细胞中具有明显的EdU阳性细胞。结论:1.EdU掺入法联合流式细胞术可用于检测体内T淋巴细胞增殖。2.优化的EdU掺入法与BrdU法检测T细胞增殖效能一致,但更简单易行。3.EdU掺入法可用于体内固有淋巴细胞的检测。目的:双阴性T细胞(double negative T cells,DNT细胞)是体内一类能够负性调节机体免疫反应的淋巴细胞,但其来源尚不清楚。我们前期研究结果发现DNT细胞可以从CD4+T细胞转化而来,而CD4+T细胞只有在经过分裂增殖之后才可以向DNT细胞转化。共刺激分子在CD4+T细胞的活化增殖中发挥了重要作用,本研究在前期研究基础上进一步探讨共刺激分子在DNT细胞转化及增殖中的作用及相关机制。方法:首先通过共刺激分子中和抗体及基因敲除(gene knockout,KO)小鼠探讨OX40、CD40及CD28共刺激信号对DNT细胞转化效率的影响,并检测转化的DNT细胞表面OX40的表达量。同时用体外培养及体内过继转移的方法,通过EdU、Annexin V及流式检测,对比B6 DNT与OX40 KO DNT细胞增殖、凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-x L、Survivin及BCL2样蛋白11(BCL2 like protein 11,BCL2L11)表达差异,明确OX40在DNT增殖调控中的作用。其次使用外源性IL-2体外刺激B6 DNT细胞,明确IL-2与OX40关系。体内外分别用IL-2 Fc蛋白/IL-2刺激B6 DNT及OX40 KO DNT细胞,通过EdU及Annexin V方法检测DNT细胞增殖、凋亡及凋亡相关蛋白变化,明确OX40是否参与IL-2对DNT细胞存活的调控。最后通过生物学预测方法确定OX40启动子上游转录因子,并结合转录因子激动剂,明确参与IL-2调控OX40分子表达的信号分子。结果:在DNT细胞转化体系中加入OX40中和抗体后,DNT细胞的转化效率明显降低,而加入CD40、CD80及CD86中和抗体后DNT细胞的转化效率无明显下降。同时利用OX40 KO小鼠来源的CD4+T淋巴细胞进行体外转化进一步证实了OX40可参与调控DNT细胞的转化。流式检测发现转化的DNT细胞表达OX40,且其表达量显著高于活化的CD4+T细胞,而凋亡率较其减少。通过体内外对比研究发现,OX40敲除后DNT细胞EdU阳性率下降,Annexin V比例增加,提示OX40 KO DNT细胞增殖减少,凋亡增加;同时流式及real-time PCR结果均显示OX40 KO DNT细胞Bcl-2、Bcl-x L、Survivin等抗凋亡基因表达低于B6 DNT,BCL2L11促凋亡基因表达高于B6 DNT,OX40敲除后NFκB1、P65信号通路活性降低。IL-2刺激使DNT细胞OX40表达增加,体内外实验对比分析B6 DNT、B6 DNT+IL-2及OX40 KO DNT+IL-2三组间DNT的活性发现,加入IL-2后DNT增殖增加、凋亡减少,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-x L、Survivin表达上调,而当IL-2刺激OX40 KO DNT细胞时,其增殖减少、凋亡增加,且上述抗凋亡基因表达出现一定程度的下降。IL-2刺激可导致DNT细胞内PPARγ下调,同时PPARγ激动剂可使DNT细胞表面OX40表达降低,增殖减少,凋亡增加,Bcl-2、Bcl-x L抗凋亡基因表达下降,BCL2L11促凋亡基因表达上升。结论:1.OX40共刺激信号可增加DNT细胞的转化效率。2.OX40共刺激分子通过NF-κB信号通路上调Bcl-2、Bcl-x L、Survivin抗凋亡基因,并下调BCL2L11促凋亡基因表达,促进DNT增殖、减少凋亡。3.IL-2可以通过直接调控OX40表达,发挥促进DNT细胞增殖,减少凋亡的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

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本文编号：1559609