TRIM14调控天然免疫反应机制研究

发布时间：2018-03-03 06:10

  本文选题：天然免疫反应　切入点：泛素化　出处：《北京协和医学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：TRIM 14 (tripartite motif-containing 14)是TRIM家族的蛋白,含有B-box 、 coiled-coil和PRYSPRY结构域。前期通过siRNA文库筛选发现TRIM 14在病毒引起的宿主天然免疫反应中具有调控功能。进一步研究表明TRIM 14定位于线粒体外膜,通过C-末端PRYSPRY结构域与RLRs (RIG-I like receptors)信号通路中的线粒体接头分子MAVS (mitochondria antiviral signaling)相互作用,并与天然免疫调节因子NEMO (NF-κB essential modulator)蛋白直接相互作用。但是,TRIM 14通过与NEMO及MAVS的相互作用调控天然免疫反应的分子机制仍不明确。另外,由于天然免疫分子的活化必须受到严格调控以防止过度炎症反应导致机体损伤,我们推测TRIM 14的活性也受到调控。鉴于此,我们深入分析了TRIM14对线粒体天然免疫的调控机制,并对TRIM 14自身活性的调控机制进行了研究。本研究将为阐明抗病毒天然免疫反应机制提供依据。本研究首先对TRIM 14与NEMO相互作用的具体机制及功能进行深入分析,以阐明TRIM 14调控线粒体天然免疫的分子机制。通过定点突变发现泛素链感受蛋白NEMO的泛素结合结构域NUB (NEMO ubiquitin-binding)和ZF (zinc finger)结构域是与TRIM 14的结合的关键结构域,删除NUB和ZF结构域严重影响NEMO与TRIM 14的结合以及I型干扰素的表达。同时,SeV感染细胞后,TRIM 14发生K63泛素化。突变分析表明,TRIM14 K365位点是K63泛素化的关键位点,该位点突变后,TRIM 14与NEMO的结合能力及诱导干扰素启动子活性的能力都下降。上述结果表明TRIM 14通过结合的泛素化链与NEMO相互作用。进一步的研究发现,SeV感染后MAVS与NEMO相互结合,并在感染6小时时达到高峰,过表达TRIM 14促进NEMO与MAVS之间的相互作用,而在THP1细胞中敲低TRIM 14后,病毒诱导的NMEO与MAVS的结合减弱,同时NEMO转移至线粒体的过程受到抑制。以上结果提示TRIM 14在病毒感染后发生泛素化并通过泛素链招募NEMO到线粒体上促进MAVS信号小体的组装,该研究结果阐释了TRIM 14介导线粒体抗病毒天然免疫反应的机制。为深入研究TRIM 14自身活性调控机制,结合TRIM 14在病毒感染过程中受到泛素化调控这一现象,我们对RLRs信号通路相关的E3泛素连接酶进行筛选,结果表明E3泛素连接酶RNF125过表达增强TRIM 14泛素化水平。免疫荧光共聚焦显示过表达的RNF125和TRIM14,共定位于线粒体。免疫共沉淀结果证明RNF125通过RING结构域与TRIM 14相互作用。进一步研究表明,RNF125通过蛋白酶体途径降解TRIM14.基于上述现象,我们推测RNF125有可能是TRIM 14的E3泛素连接酶。突变实验证明,删除RNF125的RING结构域或者突变其泛素连接酶活性位点C72/75导致RNF125丧失促进TRIM 14的泛素化。同时,体外酶促反应实验也进一步证实RNF125是TRIM 14的E3泛素连接酶。敲除RNF125的小鼠成纤维细胞(MEF)细胞在干扰素处理后,TRIM 14的表达量持续增加,而野生型MEF细胞中TRIM 14表达量在后期下降。另外,RNF125过表达抑制TRIM 14激活I型干扰素和NF-κB启动子的功能,反之,敲低RNF125,则促进TRIM 14的功能。以上实验表明RNF125对TRIM 14具有负调控功能。综上所述,TRIM 14通过K365泛素链招募NEMO至线粒体促进MAVS信号复合物的组装,正向调控抗病毒天然免疫反应。另一方面,RNF125通过促进TRIM 14泛素化导致其通过蛋白酶体降解,对TRIM 14进行负调节。本研究发现了TRIM 14调节抗病毒天然免疫反应的机制以及TRIM 14自身活性调控机制,为深入地理解宿主抗病毒天然免疫信号及其调控机制提供了依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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本文编号：1559834