骨不连的初步流行病学研究及ADAMTS-7在大鼠骨不连模型中的表达和意义

发布时间：2018-03-16 01:29

本文选题：非感染性　切入点：骨不连　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分非感染性骨不连的初步流行病学研究研究背景随着交通运输业和建筑业的发展,创伤导致骨折患者的数量一直居高不下。目前,对于骨折患者的手术治疗取得了巨大的进步。但是,作为骨折的常见和重要并发症之一——骨不连的发生仍十分常见,有报道称其发生率为5-10%。近百年以来,人们对于骨不连的病因及发生机制的研究一直未间断,虽然取得了很大的进展,但直到现在仍未有明确的结论。骨不连(nonunion)是指骨折后6-9个月骨折仍未愈合；并且已经连续观察3个月,骨折没有愈合迹象。由此可见骨不连发生的主要判断因素一个是时间,必须是骨折后达到6-9个月,二是临床上的X线判断,骨折通过连续3个月观察,骨折间隙或者骨痂的生长与上次相比无明显进展。此两个条件缺一不可。所以在临床诊断中,定义骨不连要多因素考虑,不能一概而论。尽管如此,对于骨不连的流行病学方面的研究,却罕见报道。1978年,Okhotsky报道了197例骨不连患者,并对其进行了分析,应该是最早的关于骨不连流行病学的研究。之后,Rosen、Miiller等教授也分别进行了报道。国内的刘沂教授在1986年,分析了520例骨折不愈合及骨折延迟愈合的病例,得出的结果与国外报道有所差异。这说明,关于疾病的研究,由于国情的差异等因素,我们国内应该有自己的流行病学分析,以便更好地进行疾病的诊断和治疗,具有重要的意义。国内对骨科流行病学研究较好的是河北三院的张英泽教授,其团队分别统计了他们医院入住的骨折的患者的病例,对不同部位骨折进行分析,得出此病的致病特点、分布、诊断及治疗等结果,有力的推动了骨科的发展。鉴于此,对于骨不连这种骨科常见并发症,我们拟对其进行初步的流行病学分析,总结其发病特点、类型及治疗方法,为骨不连患者的诊断和治疗提供一定的技术参考,并为今后更大范围的骨不连的流行病学分析提供一定的基础。目的了解2006年1月至2015年12月山东省立医院集团收治的非感染性骨不连患者的流行病学状况及特点,发病原因、类型及治疗方法初步分析,为今后济南地区骨不连患者的诊断、治疗及预防提供一定的技术依据,同时也为山东乃至全国范围内的骨不连患者的流行病学分析提供坚实的基础。方法对山东省立医院集团自2006年1月至2015年12月所有成人骨折术后非感染性骨不连病例进行采集。纳入标准：18岁以上患者,确诊为骨折术后非感染性骨不连,排除骨折术后延迟愈合病例,再次骨折病例及复查病例以及感染性骨不连病例。利用我院的病案查询系统进行病例的查询,查询工作由经过专业培训的调查员进行,查阅期间1名创伤骨科主任医师和1名影像学研究所的主任医师担任此次研究的质量监督,对查阅结果进行定期抽查和核对。对患者的年龄,性别,部位,骨折后的一期治疗方式,骨不连发生时间,类型,骨不连治疗方式等进行统计。由我院有骨骼影像阅片基础的骨科医师担任调查员,统计我院由2006年1月至2015年12月诊治的全部骨折术后骨不连患者的病例以及影像学资料。通过查阅影像学资料对所有骨不连病例进行分型,并统一填写其他各项指标。所有的病例资料经过采集整理后,录入Excel软件,使用统计学软件SPSS 16.0进行统计学的分析,计数资料采用卡方检验,计量资料采用t检验,趋势检验采用线性回归分析,P0.05认为差异有统计学意义。结果1.一般情况：本调查资料显示,自2006年1月1日至2015年12月31日,我院集团骨科共收治骨不连患者654例,其中男478例,女176例,男女比例为2.72：1。年龄18-83岁,平均为39.9岁。年龄分布以21-50岁患者最多见,共占73.1%。左右侧对比无明显统计学差异。发病人群多为男性青壮年体力劳动者。2.骨不连情况分析：初次骨折情况受伤原因为车祸伤为主(236例),以闭合性损伤多见(458例),大部分为单纯一部位骨折(472例),一期治疗方式以钢板螺钉固定为主,为396例；髓内钉内固定为108例。骨不连部位最多见于股骨骨折患者为268例,其次为胫腓骨,226例,上肢骨不连患者较少见。骨不连类型：其中肥大性骨不连378例,萎缩性骨不连276例,两者比例为1.37：1。我们的治疗方式主要为切新、植骨、更换内固定。内固定方式以髓内钉为主220例,其次为钢板固定164例,植骨以自体髂骨为主,占62.7%(410/654),植骨方式为360°环绕植骨,植骨量大,覆盖面广,保证愈合率。部分应用自体腓骨,缝匠肌骨瓣以及切除的骨质等。愈合率达93.5%。3.不同部位骨不连情况：不同部位的骨不连具有各自的特点。股骨骨不连最多见,以男性中青年为主,初次骨折多为闭合性,治疗多以钢板固定。骨不连的类型,肥大性骨不连166例,萎缩性骨不连102例,两者比例为1.63：1。我们对其治疗的固定方式以髓内钉为主(132/268)。胫骨骨不连的特点与股骨类似,以男性中青年为主,但初次骨折以开放性骨折为主,治疗多为钢板及外固定架为主。两种骨不连类型相当,治疗以髓内钉固定+自体髂骨移植。对于上肢骨不连,肱骨骨不连以及尺桡骨的骨不连患者,治疗方式以钢板为多见。结论1.非感染性骨不连以男性青壮年患者多见,主要分布在农民及工人职业群体中；2.非感染性骨不连患者初次损伤多以高能量损伤为主,软组织损伤重；而且一期治疗方式以加压钢板固定多见,容易血运,造成骨不连；3.非感染性骨不连发生的部位分布依次为股骨胫骨肱骨尺桡骨锁骨；不同部位的骨不连具有不同的特点,性别构成比都呈现年龄相关性；4.两种类型骨不连数量相当,性别构成比呈现年龄相关性；肥大性骨不连以股骨多见,而萎缩性骨不连以胫骨多见；5.非感染性骨不连的治疗以手术,手术方式包括切新、植骨及更换内固定；植骨以自体髂骨为主,效果优良。第二部分感染性骨不连的骨搬运治疗及其疗效评价研究背景感染性骨不连是指骨折后6-8个月发生感染并且伴有骨折不愈合,主要是由于开放性骨折内固定术后感染造成的,另外有一少部分是由于闭合性骨折手术内固定感染引起,慢性骨髓炎继发骨折也可以造成。此类患者经过多次手术,往往会导致骨感染、畸形、缺损、骨质疏松、关节僵硬、肢体不等长、局部软组织缺损、瘢痕化等诸多情况,从而使得治疗难度大,效果不佳,给骨科医师带来了很大的挑战。对于感染性骨不连的治疗,Saleh提出的目标有以下几点：1.骨与软组织的愈合；2.矫正成角以及短缩畸形；3.关节活动的恢复；4.骨折愈合；5.感染根除。传统的治疗是首先控制感染,方法有冲洗引流、皮瓣转移、创面换药、抗生素珠链等技术,待感染控制后再进行骨不连的治疗。此方法治疗周期长,效果不理想,最终有的患者可能选择截肢。从Ilizarov发现牵拉成骨现象后,到最终形成“张力-应力法则(law of tension stress,LTS)”,形成了骨搬运技术的核心理论。随着Ilizarov技术的应用和推广,感染性骨不连的治疗进入了一个新的时期。牵拉成骨技术的优势在于可以同时矫正骨缺损及短缩,并可以通过牵拉软组织修复一定程度的软组织缺损,骨搬运过程中可以下地活动,避免了关节的僵硬,微创手术,损伤小,效果好。Ilizarov技术是治疗四肢严重感染性骨不连的有效方法,已成为国际公认的金标准。目的回顾性分析近五年间山东省立医院集团应用骨搬运技术进行治疗的194例感染性骨不连的病例资料及预后,从而评估此种方法在治疗感染性骨不连的临床效果。方法统计2011年1月-2015年12月份入住山东省立医院集团创伤骨科的感染性骨不连患者的病例,挑选应用骨搬运方法治疗患者病历资料,共194例,分析治疗方法及其预后。对于此类患者的骨搬运治疗分为以下几步：1.术前准备：血沉(Erythrocyte Sedimentation Rate, ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)指标测定；细菌培养+药敏实验；术前影像学检查；选择合适的外固定架。2.病灶部位处理：要彻底清创,去除感染骨段要充分,不可姑息。3.软组织处理：对于皮肤软组织充足的,一期给予创面缝合。而对于皮肤软组织缺损较大的,尽量缩小创面,随着日后的骨搬运,创面会逐渐靠拢闭合；对于不能完全闭合的,可二期植皮处理。4.外固定架的安装：外固定架分为Ilizarov环形外固定架和Orthofix单边外固定架。根据感染骨的去除长度及截骨部位等进行综合考虑,完成安装。5.截骨部位及方法：一般选择干骺端钻孔截骨,此种方法简单、微创、效果良好。6.术后处理：术后时刻注意观察患肢的肿胀情况、远端感觉、运动、血运等。止痛、抗感染治疗,截骨术后7-10天即可开始进行搬运,速度为1mm/d,分4次进行,并早期功能锻炼。对于骨搬运治疗感染性骨不连的疗效评价根据ASAMI标准进行评定。结果本研究共纳入感染性骨不连患者194例,男女比例1.20：1。年龄平均39.6岁,发病高峰在31-40岁。致伤原因：车祸伤95例,高处坠落伤63例,砸伤36例。骨不连部位：胫骨135例,股骨42例,肱骨及尺桡骨17例。初次骨折开放性损伤123例,闭合性损伤71例。开放性骨折按照Gustilo分型标准：其中Gustilo Ⅰ型14例,Gustilo Ⅱ型39例,GustiloⅢ型70例。一期治疗方式清创+外固定架固定98例,钢板内固定61例,髓内钉内固定35例。伴有皮肤缺损患者49例,窦道形成78例。细菌培养结果显示：细菌培养结果阳性率并不高,为41.7%(53/127)；细菌培养结果显示金黄色葡萄球菌为主要致病菌,占69.8%(37/53)。194例患者中,有113例使用了Ilizarov环形外固定架,有81例应用了Orthofix单边外固定架。共有186例患者获得了随访。其中骨折已经愈合的患者有113例,愈合时间6-26个月,平均13.8个月。骨外固定时间8-28个月,平均21个月。平均愈合指数为1.78个月/cm。根据ASAMI标准,患者的骨折愈合,优82例,良23例,中6例,可2例,优良率为92.9%。功能评定,优76例,良23例,中11例,可3例,优良率为87.6%。23例发生钉道感染。5例在骨搬运过程中发生提前矿化。3例在骨搬运过程中发生了肢体远端的剧烈疼痛及感觉明显减退症状。12例发生皮肤内陷行皮肤松解处理。8例发生力线偏移,后给予调整外固定架处理。有6例出现了膝关节粘连,通过手术松解后恢复。所有患者中,未再出现感染复发及骨不连的情况。结论骨搬运技术治疗感染性骨不连,操作简单,疗效确切,是治疗感染性骨不连行之有效的方法,值得推广和应用。第三部分大鼠骨不连模型的构建以及ADAMTS-7在骨不连模型中的表达和意义研究背景骨不连(nonunion)是骨折正常愈合过程的终止,如不进一步积极采取措施处理,决不会发生骨折愈合。骨不连不仅给患者带来了巨大的疼痛和肢体功能障碍,同时也增加了患者及社会的经济负担。目前针对骨不连的治疗没有行之有效的方法。因此,对骨不连发生的分子生物学机制还有待于进一步研究。ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin motifs;含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶)家族已经被发现多年,最初发现于1997年,这类金属蛋白酶在ECM (extracellular matrix,细胞外基质)成分中占有很大比例。ADAMTS家族成员在多个生理过程中具有重要的功能,例如参与胶原的处理、聚集蛋白聚糖的降解、抑制血管再生、参与血凝平衡等。ADAMTS-7属于ADAMTS家族,是一种新的金属蛋白酶。2009年X.H. Bai报道了关于ADAMTS-7调控软骨形成、软骨钙化的研究结果,这是国际上首次揭示ADAMTS-7在抑制软骨生成、软骨成骨中的作用。ADAMTS-7也可以直接结合并降解关节软骨细胞外基质中的COMP (cartilage oligomeric matrix protein,软骨寡聚基质蛋白)蛋白,导致关节炎发生。相关研究表明：在小鼠胚胎体内软骨发育过程中,软骨细胞内的ADAMTS-7的表达量都逐渐增高；ADAMTS-7作为PTHrP (parathyroid hormone related peptide,甲状旁腺激素相关肽)的下游分子,在软骨形成中起负调控作用,并通过降解GEP(granulin-epithelin precursor,颗粒体蛋白-上皮素前体),显著抑制骨的生长和钙化,提示ADAMTS-7很可能参与骨不连的发生。并对骨不连的发生起重要的作用。但国内外关于ADAMTS-7生物学功能的研究甚少,尤其是其在骨不连发生中的作用方面,目前尚未见相关研究报道。目的构建大鼠骨不连模型,检测在骨不连发生过程中ADAMTS-7的不同时间点的表达情况,为探究ADAMTS-7影响骨不连发生的分子机制,从而为利用ADAMTS-7纯化蛋白局部导入等方式治疗骨不连奠定基础。方法1.实验分组40只成年Wistar大鼠随机分为两大组：骨不连组(实验组)和骨折组(对照组),每组各20只。每一组按照术后采集标本的时间点分为5个亚组,即为术后3天、7天、14天、28天、56天采集标本的亚组。2.大鼠骨折及骨不连模型的构建及骨折愈合情况评估使用Bonnarens和Einhorn介绍的方法,对大鼠股骨造成横行骨折后,骨不连组通过电刀灼烧骨膜的方法制作骨不连模型,骨折组不进行灼烧。每个时间点：3天、7天、14天、28天、56天,通过大体解剖观察、X线检查、组织病理学检查等观察骨折愈合情况。3.免疫组织化学染色法检测骨不连模型不同时间点的ADAMTS-7的表达情况取保存的大鼠股骨组织进行脱钙后,制作石蜡切片。按照免疫组织化学染色的步骤,将切片进行抗原修复、免疫组化染色(SABC法),后晾干进行显微镜下观察。采用免疫组化的方法,观察骨折愈合、骨不连发生不同时期组织中ADAMTS-7的定位以及表达情况。4. Wetern-blot方法检测骨不连模型不同时间点的ADAMTS-7蛋白的表达情况取保存的组织进行组织蛋白提取,后进行电泳、转膜,一抗及二抗孵育后进行显影,观察不同时间点组织中的ADAMTS-7在蛋白水平的表达情况。5. Real-time PCR方法检测骨不连模型不同时间点的ADAMTS-7在mRNA水平的表达情况提取骨折断端组织mRNA,利用real time PCR技术分析ADAMTS-7在]mRNA水平的表达情况。结果1.建立大鼠骨不连模型：大鼠股骨骨折手术后8周成功发展为骨不连,通过大体解剖观察、X线及组织病理学检查的方法得到证实。大体可见断端可活动,硬化,骨折线明显。X线示骨折线明显,无明显骨痂形成。而组织病理学检查示：骨折断端纤维组织填充,无明显骨性骨痂形成。2.骨不连模型不同时间点的ADAMTS-7的表达情况：通过免疫组织化学方法检测,骨不连组组织中的ADAMTS-7明显表达,主要分布在软骨细胞及骨细胞,骨折正常愈合组的表达较骨不连组少。Western blot和Real-time PCR显示：ADAMTS-7在不同的时间点表达不同,在第3天时表达较低,之后从第7天开始表达量显著增加,并且一直维持在较高的表达水平。而骨折正常愈合组,从术后第7天开始,表达量逐渐下降,直至术后第56天骨折愈合后,恢复至术后3天的正常水平。结论1.断端骨膜灼烧及骨髓去除法,可以成功的制作骨不连模型,此方法简单、有效、成功率高；2. ADAMTS-7在骨不连的发展过程中处于高表达状态,其对骨不连的形成具有正向调控作用；3. ADAMTS-7通过抑制软骨的成长和分化来使软骨内成骨过程发生障碍,从而导致骨不连的发生；4.通过检测ADAMTS-7的表达水平可以动态观察骨折的愈合情况,从而预测骨折的预后。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R683;R-332

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