microRNA工作网络在巨噬细胞分化与功能中作用的研究

发布时间：2018-03-17 23:22

本文选题：microRNA　切入点：巨噬细胞　出处：《吉林大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：micro RNA(mi RNA)是一种由21-25个碱基组成的非编码单链核苷酸序列,通过特异性结合m RNA从而抑制其翻译过程。mi RNA通过调控蛋白质的合成从而参与调控几乎所有的细胞代谢,甚至很多疾病的发生也与mi RNA有密切关系。目前mi RNA的临床应用也在逐渐被开发,之前的研究表明,mi RNA检测在疾病的诊断、治疗和预后判断上具有重要价值。如,mi R-21在恶性肿瘤中普遍升高,对肿瘤具有较高的诊断和判断预后作用;mi R-155在B细胞淋巴瘤中明显上升,mi R-155基因位点的突变可做为B细胞淋巴瘤的检测指标;抑制活体内mi R-126水平可明显减轻哮喘症状,说明其在哮喘中的治疗价值。虽然mi RNA的研究仅有几十年的历史,但它们为疾病的发生、诊断、治疗等方面的作用已被大量开发。探讨各种mi RNA在细胞中的作用和机制也成为一门重要的学科。巨噬细胞是机体免疫系统及其关键的组成部分,参与先天免疫和适应性免疫,在对抗外来病原体、参与炎症反应和组织修复方面发挥重要作用。研究认为,多种疾病的发生都与巨噬细胞有密切关系:由于巨噬细胞对机体免疫和防御反应方面具有重要功能,缺乏会导致抵抗下降,使机体发生感染的机会大大增加;M2型巨噬细胞主要可激活Th2相关疾病如哮喘等,还对肿瘤的发生发展具有促进作用;同时巨噬细胞在脂质代谢方面发挥重要作用,巨噬细胞摄取修饰低密度脂蛋白过多会导致细胞内脂质堆积,向泡沫细胞转化,发生动脉粥样硬化。mi RNA作为近十几年来兴起的一种调控因子,在巨噬细胞代谢中发挥重要作用,mi RNA通过调控细胞因子的合成,从而调控巨噬细胞功能。然而,尽管之前有很多研究发现mi RNA在巨噬细胞的免疫反应、脂质代谢中具有重要作用,但很少有研究从起源上探讨巨噬细胞生长分化相关的mi RNA。目前广泛认为,组织巨噬细胞的更新主要来源于骨髓前体细胞的分化,巨噬细胞的分化异常会导致正常巨噬细胞数目下降或功能异常,从而诱导相关疾病的发生。探索mi RNA在骨髓细胞向巨噬细胞分化中的工作网络及其调控机制引起了我们的兴趣。因此,从众多mi RNA中筛选出与巨噬细胞分化相关的mi RNA成为一个亟待解决的问题。我们的实验目的是通过microarray技术从上千种mi RNA中筛选出与巨噬细胞生长分化相关的mi RNA,并分析这些mi RNA与巨噬细胞成熟、免疫炎症反应、脂质代谢等功能相关分子之间的关系,构建mi RNA在这些巨噬细胞中的调控网络,从理论上筛选出参与巨噬细胞分化和功能的mi RNA及其相关分子通路,我们后续的实验将会进一步验证这些理论通路。该实验是首次分析巨噬细胞分化过程中的mi RNA工作网络,并筛选出大量之前未被发现的巨噬细胞功能相关mi RNA,并提出mi RNA调控的分子通路假说,具有重要的研究价值。实验方法:1.选取6-8周野生型BALB/c小鼠作为实验对象,分离骨髓细胞后应用巨噬细胞培养基培养,诱导骨髓细胞分化,第3、5、7天收集细胞,Giemsa染色观察细胞形态,FACS测定巨噬细胞比例,细胞计数器测量细胞的数目;2.提取细胞m RNA,用microarray方法检测骨髓细胞和第3、5、7天巨噬细胞的mi RNA表达水平;筛选表达变化最明显的mi RNA,通过Target Scan分析这些mi RNA的靶基因,并用Me SH数据库分析这些mi RNA调控的与巨噬细胞生长和功能有关的靶分子,通过Venn图找出这两种方法所得分子的重叠部分;3.将上述参与巨噬细胞生长功能的mi RNA靶标进行分析,通过Ingenuity Pathways Analysis(IPA)系统研究这些分子参与的巨噬细胞相关的信号通路,以及与巨噬细胞关键性分子密切相关的mi RNA。并总结具有多功能的mi RNA。实验结果:1.FACS结果发现,分化第3、5、7天收集的贴壁细胞中巨噬细胞百分比分别为92.2%、96%、99%。Gimsa染色示巨噬细胞从第3到7天巨噬细胞成熟过程中逐步发生形态学变化。细胞计数结果显示骨髓细胞、第3、5、7天巨噬细胞浓度呈明显上升趋势。2.共有112种mi RNA在巨噬细胞分化过程中发生明显变化,即上调或下调5倍以上。在第3天,56种mi RNA表达下降而58种mi RNA表达升高。第5天和第7天,66种mi RNA降低而48种mi RNA升高。3.Target Scan和Me SH软件发现,上述112种mi RNA共有8367种靶标分子,其中1267种靶标分子参与巨噬细胞的分化和功能,IPA分析发现这1267种分子与30种巨噬细胞经典信号通路密切相关。如HGF、IL-6、NGF等通路参与调控细胞的生存和凋亡,糖皮质激素受体、NF-κB,RANK等通路是巨噬细胞炎症反应通路。4.通过加入mi Randa和Ingenuity Pathways Analysis(IPA)分析系统,进一步研究这112种mi RNA与巨噬细胞关键性功能分子的关系,我们发现18种mi RNA可能参与调节CSF1R,CD36,MSR1和SCARB1这四种巨噬细胞相关受体;7种mi RNA与转录因子RUNX1和PU.1的调节有关;14种mi RNA与PPARα和PPARγ的m RNA有潜在的结合位点;17种mi RNA与TLR2、3、4、7、13这几种受体的调节有关。5.通过分析上述生物信息软件发现的与巨噬细胞关键性分子相关的mi RNA,我们发现mi R-155、mi R-18b、mi R-542-3p、mi R-152、mi R-129-5p、mi R-130a这6种mi RNA分别调控4种巨噬细胞分子;mi R-141和mi R-221这两种mi RNA分别调控3种分子,mi R-24、mi R-150、mi R-22、mi R-34a、mi R-326、mi R-363、mi R-27b、mi R-101a、mi R-144、mi R-181c这10种mi RNA参与调控两种分子。这些多功能mi RNA,尤其是调控4种巨噬细胞分子的6种mi RNA在以后研究巨噬细胞分化和功能中具有重要价值。结论:1.本研究用microarray的方法筛选出在骨髓巨噬细胞分化过程中明显变化的mi RNA,并通过Target Scan和Me SH等软件筛选出这些mi RNA的靶标中与巨噬细胞分化和功能有关的分子,以及这些靶标分子参与的信号通路。2.通过Target Scan、Mi Randa、IPA等软件分析上述mi RNA以及巨噬细胞关键性分子如MSR1、CD36、SCRAB1、CSF1R、RUNX1、PU.1、PPARα、PPARγ、TLR2、TLR3、TLR4、TLR13和TLR7,筛选与这些分子相关的mi RNA,构建相应的mi RNA调控网络。3.通过讨论分析,确定了具有重要研究价值的mi RNA及其参与调控的分子和功能,我们将在后续的实验中进一步验证这些通路,发掘出更多的巨噬细胞相关mi RNA,为以后研究巨噬细胞相关疾病提供理论基础。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

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