鼠伤寒沙门菌诱导细胞自噬的机理研究

发布时间：2018-03-21 22:21

  本文选题：鼠伤寒沙门菌　切入点：自噬　出处：《扬州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：自噬是真核生物进化上相对保守的细胞内代谢过程,其主要功能是清除受损细胞器、错误折叠蛋白以及入侵的病原菌。自噬始于双层膜囊泡自噬小体的产生,其不断延伸包围周围细胞质成分和细胞器,最终通过与溶酶体的融合降解底物从而实现小分子的循环再利用。自噬以非选择性和选择性两种方式降解底物。自噬作为天然免疫的一部分保护细胞受损。自噬的调控机理研究发现,mTOR和AMPK两个激酶在自噬中起重要重要。mTOR是自噬的负调控分子并发挥“门卫”作用。AMPK被认为是调节细胞能量代谢的开关,细胞自噬的感受器。AMPK和mTOR分别感知能量压力和营养物质消耗。AMPK通过上游的LKB1激活。本实验室的最近研究发现,TAK1,也能激活AMPK。AMPK磷酸化ULK1 S555位点并激活ULK1。mTOR与多个互作蛋白结合形成mTOR复合体1(mTORC1),mTORC1可磷酸化ULK1/2 S757位点从而抑制其活性。营养缺乏或mTOR抑制剂雷帕霉素抑制mTORC1活性激活ULK1并诱导自噬。自噬作为细胞抵抗胞内病原菌的第一道防线,与天然免疫协同作用,共同抵御细菌入侵,在病理生理学上具有重要意义。鼠伤寒沙门菌是一种兼性胞内寄生菌,该菌是引起肠炎的最常见的沙门菌。沙门菌入侵胞内后形成沙门菌囊泡(Salmonella containing vesicle,SCV)并在其内增殖。部分囊泡由于沙门菌释放的Ⅲ型分泌系统效应蛋白导致囊泡的胞膜受损,细菌进入胞浆后激活选择性自噬。但沙门菌激活自噬的机理并不是很清楚,特别是AMPK和mTOR两个重要的调控自噬的激酶是调控沙门菌诱导的自噬存在很大的争议。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7和人宫颈癌HeLa细胞系为模式细胞,研究鼠伤寒沙门菌能否诱导自噬发生,探究自噬发生的机制以及自噬在鼠伤寒沙门菌胞内增殖中的作用。首先,我们利用Western blot技术对鼠伤寒沙门菌感染下的RAW264.7细胞和HeLa细胞的LC3和p62的表达情况进行检测;利用共聚焦显微镜观察自噬是否可以靶向入侵的鼠伤寒沙门菌,即红色荧光细菌是否与GFP-LC3共定位;对鼠伤寒沙门菌以及自噬抑制剂氯喹(CQ)和巴弗洛霉素(bafilomycin A1)处理的HeLa细胞中的LC3表达水平进行比较。结果显示,鼠伤寒沙门菌增加RAW264.7和HeLa细胞中LC3-II/LC3-I的比值但降低p62的表达水平;CQ和bafilomycin A1能进一步增加鼠伤寒沙门菌作感染后的LC3-II/LC3-I比值;GFP-LC3与RFP标记的鼠伤寒沙门菌在HeLa细胞中共定位。这些结果表明自噬的确可以靶向入侵的鼠伤寒沙门菌。其次,我们利用Western blot技术检测了不同MOI鼠伤寒沙门菌感染不同时间下与自噬相关的信号通路中的蛋白磷酸化水平(AMPK、ULK、mTOR、S6K1、S6),检测了 AMPK抑制剂Compound C和TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol预处理鼠伤寒沙门菌作用下细胞AMPK和ULK蛋白的磷酸化水平以及LC3和p62的表达水平。结果显示,鼠伤寒沙门菌抑制HeLa细胞中但增加了 RAW264.7细胞中mTOR、S6K1和S6蛋白的磷酸化。鼠伤寒沙门菌增加RAW264.7和HeLa细胞中AMPKT172的磷酸化。鼠伤寒沙门菌增加了 RAW264.7细胞但抑制了 HeLa细胞中ULKs555的磷酸化,Compound C与5Z-7-oxozeaenol可抑制鼠伤寒沙门菌诱导的RAW247.6细胞中AMPK和ULK的磷酸化。最后,我们利用菌落计数法对AMPK在鼠伤寒沙门菌自噬中的作用进行评估。结果显示,AMPK抑制剂Compound C的加入可以短暂地增加细菌在HeLa细胞内的增殖能力,表明细胞能够通过AMPK诱导的自噬清除胞内的鼠伤寒沙门菌。综上所述,鼠伤寒沙门菌在RAW264.7细胞中主要通过磷酸化激活AMPK-ULK诱导自噬,而在HeLa细胞中,鼠伤寒沙门菌可通过抑制mTOR磷酸化和增加AMPK磷酸化来诱导自噬。
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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378
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本文编号：1645825