NDRG2调控星形胶质细胞摄取谷氨酸的作用及机制研究

发布时间：2018-03-21 22:35

本文选题：NDRG2　切入点：谷氨酸　出处：《第四军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：谷氨酸是中枢神经系统内重要的兴奋性神经递质,在神经系统发育及维持突触可塑性等方面发挥重要作用。在生理状态下,谷氨酸起信号传导作用。在病理状态下,谷氨酸浓度在细胞外液迅速升高[1]。高浓度的谷氨酸引起神经元细胞内Ca~(2+)超载,最终导致神经元死亡[1],即谷氨酸的兴奋毒性[2]。因此,迅速有效地将突触间隙的谷氨酸移除有利于维持正常的突触传递功能。突触间隙不存在使谷氨酸灭活的酶,从突触间隙摄取谷氨酸是终止谷氨酸作用的最主要途径。谷氨酸的移除主要依赖兴奋性氨基酸转运体EAATs,EAATs能逆浓度梯度将谷氨酸转移至细胞内。在中枢神经系统,负责谷氨酸摄取的主要细胞是星形胶质细胞[3,4]。星形胶质细胞Na~+依赖性的谷氨酸转运体是EAAT1和EAAT2。EAATs每转运1个谷氨酸分子,伴有3个Na~+和1个H~+同向转运至细胞内,1个K~+转移至细胞外[5]。这种跨膜转运的能量来源是Na~+-K~+-ATP酶形成的Na~+、K~+电化学浓度梯度。但是,星形胶质细胞调节谷氨酸摄取的关键分子和机制尚未明了。在中枢神经系统,NDRG2特异性表达于星形胶质细胞[6,7]。在脑内兴奋性毒性状态下,如缺血[8]、创伤[9]和AD[10]时表达上调。既往研究证实:Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基能与NDRG2相互作用,NDRG2通过抑制Na~+/K~+-ATPaseβ1蛋白泛素化起到稳定后者的作用[11]。为了研究在生理及病理状态下NDRG2的功能,我们构建了NDRG2敲除(Ndrg2-/-)小鼠。这些小鼠表现为运动亢进和脑细胞外液谷氨酸增多,推测该基因可能是调节谷氨酸摄取的关键分子。本研究旨在探讨表达于星形胶质细胞的NDRG2是否通过影响细胞Na~+/K~+-ATPase活性进而影响星形胶质细胞EAAT1、EAAT2对谷氨酸的摄取从而发挥保护作用?第一部分NDRG2调节脑组织细胞外液谷氨酸浓度,保持谷氨酸浓度的动态平衡目的:探讨NDRG2对小鼠运动距离、运动速度及脑组织细胞外液谷氨酸浓度的影响。方法:选取6~8周龄雄性C57BL/6J、Ndrg2-/-小鼠,Ndrg2-/-小鼠用LV-NDRG2或LV-Ctrl进行侧脑室注射,五天后进行旷场实验,观察小鼠5 min内的运动距离和运动速度,HPLC法检测小鼠纹状体微透析液中谷氨酸和GABA的浓度。结果:Ndrg2-/-小鼠运动距离和运动速度明显高于WT鼠,表现为更大的兴奋性(p0.01),进一步研究发现Ndrg2-/-小鼠微透析液中谷氨酸浓度明显高于WT组(p0.01),但GABA的含量没有明显的变化。注射LV-NDRG2恢复Ndrg2-/-小鼠NDRG2表达后,可以逆转上述现象。结论:中枢神经系统NDRG2的表达水平影响小鼠的兴奋性,NDRG2缺失,小鼠表现为更高的兴奋性,这种兴奋性增高与脑组织细胞外液主要的兴奋性氨基酸-谷氨酸含量升高有关。第二部分NDRG2促进星形胶质细胞对谷氨酸的摄取目的:观察NDRG2对星形胶质细胞摄取谷氨酸能力的影响。方法:分离纯化WT及Ndrg2-/-原代星形胶质细胞,Ndrg2-/-星形胶质细胞用LV-NDRG2或LV-Ctrl转染。用含200μM FITC-谷氨酸的DMEM培养基作用于星形胶质细胞不同时间(0、5 min、30 min、60 min、120 min),共聚焦显微镜下观察细胞荧光强度的变化。结果:在不同时间点(5 min、30 min、60 min、120 min)Ndrg2-/-星形胶质细胞内荧光强度明显低于WT组(p0.01),Ndrg2-/-星形胶质细胞对谷氨酸的摄取能力,无论量还是速度都出现明显的减低(p0.01)。用LV-NDRG2转染Ndrg2-/-原代星形胶质细胞恢复NDRG2的表达,与LV-Ctrl组相比,星形胶质细胞对FITC-谷氨酸的摄取能力得以恢复。结论:NDRG2促进星形胶质细胞摄取谷氨酸。第三部分NDRG2促进星形胶质细胞Na~+依赖性的谷氨酸摄取目的:探讨NDRG2影响星形胶质细胞摄取谷氨酸的可能机制。方法:分离纯化WT及Ndrg2-/-原代星形胶质细胞,Ndrg2-/-星形胶质细胞用LV-NDRG2或LV-Ctrl转染。Na~+/K~+-ATPase检测试剂盒检测细胞Na~+/K~+-ATPase的活性,Coro Na检测细胞内Na~+浓度。Western blot检测星形胶质细胞NDRG2、EAAT1、EAAT2、Na~+/K~+-ATPaseα1、Na~+/K~+-ATPaseβ1的表达变化。结果:与WT星形胶质细胞相比,Ndrg2-/-星形胶质细胞Na~+/K~+-ATPase活性明显降低(p0.05),细胞内Na~+荧光强度明显升高(p0.01),Ndrg2-/-星形胶质细胞EAAT1、EAAT2和Na~+/K~+-ATPaseβ1表达明显降低(p0.01),而Na~+/K~+-ATPaseα1的表达没有变化。用LV-NDRG2转染Ndrg2-/-星形胶质细胞恢复NDRG2表达后,可以逆转上述变化。结论:NDRG2增强Na~+/K~+-ATPase活性,降低细胞内Na~+浓度,促进星形胶质细胞EAAT1、EAAT2和Na~+/K~+-ATPaseβ1的表达,促进Na~+-依赖性的谷氨酸摄取,从而发挥保护作用。第四部分NDRG2通过与Na~+/K~+-ATPase相互作用调节星形胶质细胞对谷氨酸的摄取目的:探讨NDRG2影响星形胶质细胞摄取谷氨酸的分子靶点。方法:从WT及Ndrg2-/-小鼠分离、纯化星形胶质细胞。LV-β1或LV-Ctrl转染Ndrg2-/-星形胶质细胞上调Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基表达,Western blot检测星形胶质细胞NDRG2、EAAT1、EAAT2、Na~+/K~+-ATPaseα1、Na~+/K~+-ATPaseβ1的表达变化,共聚焦显微镜观察星形胶质细胞对FITC-谷氨酸的摄取能力。免疫共沉淀的方法确定NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基是否存在相互作用。阻断NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基的相互作用,检测对星形胶质细胞摄取FITC-谷氨酸能力的影响,并检测细胞Na~+/K~+-ATPase活性及细胞内Na~+浓度结果:当我们用LV-β1转染Ndrg2-/-星形胶质细胞上调Ndrg2-/-星形胶质细胞Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基的表达后,与LV-Ctr组相比,EAAT1和EAAT2表达上调(p0.01),而Na~+/K~+-ATPaseα1的表达没有变化,星形胶质细胞对FITC-谷氨酸的摄取能力明显增加(120 min时,与Ndrg2-/-~+LV-Ctrl组相比,p0.01)。通过免疫共沉淀的方法,我们确定NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基存在相互作用。阻断NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基的相互作用,星形胶质细胞对FITC-谷氨酸的摄取能力明显降低(p0.01),细胞内Na~+/K~+-ATPase活性降低(p0.05)、细胞内Na~+浓度升高(p0.01)。结论:NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基存在相互作用。上调Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基的表达及增强Na~+/K~+-ATPaseβ1同NDRG2的相互作用,能促进星形胶质细胞Na~+依赖性的谷氨酸摄取。第五部分NDRG2通过促进星形胶质细胞对谷氨酸的摄取降低谷氨酸对神经元的兴奋毒性损伤目的:观察NDRG2通过促进星形胶质细胞对谷氨酸的摄取降低对神经元的兴奋毒性损伤方法:星形胶质细胞和神经元建立直接共培养和间接共培养体系。直接共培养体系中,检测谷氨酸对神经元NMDAR1膜转位的影响。间接共培养体系中,用含200μM谷氨酸的培养基共培养120 min后,检测谷氨酸浓度,神经元用不含谷氨酸的培养基继续培养24 h后,检测LDH释放率和神经元死亡率。阻断NDRG2与Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基相互作用后,观察星形胶质细胞谷氨酸摄取能力的变化及谷氨酸对神经元兴奋毒性的影响。结果:在直接共培养体系中,与WT共培养组相比,Ndrg2-/-共培养组神经元NMDAR1膜转位明显增加,神经元胞体及突起NMDAR1明显增加。间接共培养体系中,与WT星形胶质细胞组相比,Ndrg2-/-星形胶质细胞培养上清中谷氨酸、LDH明显升高(p0.01),神经元死亡率是明显增加(p0.01)。用LV-NDRG2转染Ndrg2-/-星形胶质细胞恢复NDRG2表达后,可以逆转上述变化。阻断NDRG2同Na~+/K~+-ATPaseβ1亚基相互作用后,星形胶质细胞对谷氨酸的摄取能力降低,加重对神经元的兴奋毒性损伤。结论:NDRG2通过与Na~+/K~+-ATPaseβ1相互作用促进星形胶质细胞摄取谷氨酸,抑制神经元表面NMDAR1移位,减轻谷氨酸对神经元的毒性损伤,从而发挥保护作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R338

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