痛愈舒颗粒对寒凝血瘀型内异症大鼠模型ANXA2、RAC1和LIMK1的影响

发布时间：2018-03-25 23:42

本文选题：寒凝血瘀证　切入点：子宫内膜异位症　出处：《黑龙江中医药大学》2016年博士论文

【摘要】：目的：1利用SD大鼠建立中医病症结合的寒凝血瘀型内异症大鼠模型,通过该模型观察不同时期所建立的移植内膜形态学变化及镜下病理学改变,确定寒凝血瘀型内异症大鼠模型的治疗性给药时间点及预防性给药时间点。2观察痛愈舒颗粒不同治疗剂量对寒凝血瘀型内异症大鼠模型的影响,通过比较移植内膜体积变化,检测正常和异位内膜ANXA2、RAC1、LIMK1的表达差异,提出“伏寒伤肾,致瘀损络”为寒凝血瘀型内异症的中医病机,探讨痛愈舒颗粒治疗寒凝血瘀型内异症的基础医学作用机制,通过中西医结合为临床试验提供依据。3分别观察痛愈舒颗粒的预防性剂量以及治疗性剂量对寒凝血瘀型内异症大鼠模型的影响,通过对比用药后移植内膜体积的变化,并检测异位内膜ANXA2、RAC1、 LIMK1的表达差异,探讨痛愈舒颗粒预防性用药的可行性及相应的作用机制。方法：1实验一：选取30只雌性未交配SD大鼠随机分为对照组5只、模型组25只。采用将自体子宫内膜移植法和冰水浸泡法相结合的方式建立寒凝血瘀型内异症大鼠模型。模型组随机分为5组,分别在造模后第3天、第5天、第4周、第6周及第8周观察造模大鼠的中医表征,测量移植内膜体积,获取组织内膜通过HE染色进行病理学观察,组间进行对比。2实验二：选取112只雌性未交配SD大鼠随机分为对照组12只、模型组100只。模型组按实验一方法建立寒凝血瘀型内异症大鼠模型。术后4周进行开腹探查,选取72只成功建模的SD大鼠随机分为模型4周组、模型8周组、中低组(经痛愈舒中药低剂量组)、中中组(经痛愈舒中药中剂量组)、中高组(经痛愈舒中药高剂量组)和西药组各12只。模型4周组直接处死进行病理学检查,用药组每日同一时间按相应药物及剂量进行灌胃。模型8周组与对照组行生理盐水每日灌胃。灌胃4周后全体处死。所有造模大鼠测量异位内膜体积变化：病灶取材进行HE染色及病理学观察；通过RT-PCR和Westernblot检测组织中ANXA2mRNA和ANXA2蛋白的表达情况；通过免疫组化检测组织中ANXA2、RAC1和LIMK1的表达。确定经痛愈舒的最佳用药剂量。3实验三：选取60只雌性未交配SD大鼠随机分为对照组12只、模型组48只。模型组按实验一方法建立寒凝血瘀型内异症大鼠模型。术后5天开腹探查,选取36只成功建模的大鼠随机分为预防组、模型4周组、中高组。预防组术后5天开始每日冰水浸浴,持续2周,同时开始予以高剂量经痛愈舒灌胃,用药4周后处死。模型4周组术后1周开始冰水浴,持续2周,术后4周处死。中高组术后1周开始冰水浴,持续2周,术后4周开始高剂量经痛愈舒灌胃,持续4周,术后8周处死。所有大鼠标本观察项目同实验二。结果：1实验一结果：通过改良的自体移植法和冰水浸泡法相结合建立寒凝血瘀型内异症大鼠模型,造模成功率为76%。所建模型大鼠寒邪表征稳定,停止冰水浴后寒凝血瘀征象持续存在。通过所建模型观察移植内膜变化,造模3天,移植物形状无明显改变；造模后5天病灶表面可见新生血管出现,周围可见炎性反应；造模4周移植物体积较前明显增大,可见典型的内异症表现；造模6周的移植物与4周时进行比较,其外观无明显变化或体积略有增大；造模8周时部分移植物出现体积缩小。通过比较不通时期异位内膜病灶体积变化,我们观察到：腹壁病灶在造模后4周,平均体积达到高峰,持续到造模8周左右,造模第8周以后,部分病灶体积开始缩小。确定造模4周为治疗性用药的干预时间点,造模5天为预防性用药的干预时间点。2实验二结果：本组寒凝血瘀型内异症大鼠成模率80%。通过用药治疗,中药组模型大鼠的寒凝血瘀外观明显改善,西药组无明显变化。各治疗组移植的异位病灶体积明显缩小,以中高组和西药组的变化最为明显。通过对异位组织标本的病理学观察,各治疗组异位内膜的腺体及间质出现不同程度的生长受限,以中高组和西药组的变化最为明显。3 RT-PCR和Western blot结果显示：与空白对照组比较,各模型组和治疗组ANXA2 mRNA和蛋白的表达均出现不同程度的增高；与模型4周组进行比较,ANXA2在模型8周组的表达有所升高,各治疗组ANXA2的表达出现不同程度的降低,中高组与西药组的表达无显著性差异。ANXA2 mRNA与ANXA2蛋白的表达趋势具有一致性。4免疫组化结果显示,与对照组比较,ANXA2、RAC1和LIMK1在各模型组和治疗组的表达出现不同程度的升高；与模型4周组比较,三项指标在模型8周组的表达均有不同程度的表达升高,而在各治疗组的表达出现不同程度的降低,中高组与西药组的表达无明显差异。Pearson相关分析显示,三者的表达趋势存在正相关。5实验三结果：本组寒凝血瘀型内异症大鼠成模率75%。。预防组大鼠未出现明显寒凝血瘀的表现。预防组经过用药移植内膜体积明显缩小,同时预防组移植内膜体积明显小于中高组的内膜体积。6 RT-PCR和Western blot结果显示：与空白对照组比较,各模型组ANXA2mRNA和蛋白的表达均出现不同程度的增高；与模型4周组进行比较,ANXA2在预防组和中高组的表达均出现明显降低,；预防组的表达低于中高组的表达。ANXA2 mRNA与ANXA2蛋白的表达趋势具有一致性。7免疫组化结果显示：与对照组进行比较,ANXA2、RAC1和LIMK1在各模型组中的表达出现不同程度升高；与模型4周组进行比较,3项指标在预防组和中高组的蛋白表达量均明显降低；预防组的蛋白表达量低于中高组。Pearson相关分析显示,三者的表达趋势存在正相关。结论：1.结合自体移植法和冰水浸浴法,选取SD大鼠,建立寒凝血瘀型内异症大鼠模型,获取的移植内膜具备病理学检测的成模标准,通过该造模方法可获得稳定的,可重复的研究模型。2.提出了“伏寒伤肾,致瘀损络”的中医学关于内异症的理论,从基础医学研究关于“内异症3A理论”中的粘附角度进行探索,通过中西医结合的实验手段探讨内异症的病机、寻找治疗内异症的靶点并指导临床用药。3.ANXA2mRNA和ANXA2蛋白在异位内膜组织中的表达明显升高,并随病情的进展与缓解出现表达量的相应变化,推测ANXA2在内异症的发生发展过程中具有一定的作用。异位内膜组织中的ANXA2、RAC1和LIMK1存在一致的表达趋势,推测ANXA2可能通过ANXA2-RAC1-LIMK1这一信号通路促进病变发展,其通路上的分子标志物可作为疾病发展预测的监测指标和治疗靶点。4.痛愈舒颗粒可有效抑制寒凝血瘀型内异症的病情进展,促进异位内膜的萎缩,降低组织中ANXA2、RAC1和LIMK1的表达,具有与西药相同的治疗效果,在改善寒凝表征方面比西药更具优势。通过实验最终确定高剂量的痛愈舒颗粒是临床治疗寒凝血瘀型内异症的最佳剂量。5.预防性的应用痛愈舒颗粒具有对异位内膜更好的抑制作用,相较于针对成熟异位内膜的用药,预防性用药具有更好的治疗效果。
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【学位授予单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285.5;R-332

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