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结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2657c表位预测、重组蛋白制备及其免疫学特性的初步研究

发布时间:2018-04-02 04:23

  本文选题:结核分枝杆菌 切入点:Rv2657c蛋白 出处:《河北北方学院》2017年硕士论文


【摘要】:结核病是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的传染病,主要通过呼吸道传播。据报道2015年结核病患者已超过1000万,严重威胁着人类的健康。MTB感染人体后可出现三种不同的结果,一是机体免疫力较好,MTB直接被清除;二是MTB被机体免疫抑制,但也不能完全清除,发展为结核潜伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI);三是MTB在机体内迅速增殖,发展成活动性结核病。世界卫生组织估计全球1/3的人口是MTB的潜伏感染人群,而新发现的肺结核患者有85%-90%是由潜伏感染人群发展而来,故若能早期诊断LTBI者,并尽早对其进行预防治疗可大大降低结核病的发病率。但是目前缺乏监测、诊断LTBI的有效而可靠的标志物。LTBI的筛查对于结核病的防控具有重要的意义和价值。本研究的目的是试图发现LTBI的诊断标记物。在机体处于LTBI阶段时,潜伏感染相关蛋白会上调表达,有可能成为潜伏感染的诊断标志物。Rv2657c是MTB处于营养缺乏状态时上调表达的蛋白,其编码基因位于MTB与卡介菌(M.bovis Bacille Calmette-Guerin,BCG)基因组的差异区(region of difference,RD)。Rv2657c蛋白由86个氨基酸组成,基因长度为261bp,相对分子质量为9506.8Da,等电点为9.2211,分泌可能的phirv2噬菌体蛋白,功能未知。本研究应用DNAStar软件预测Rv2657c蛋白的T细胞和B细胞表位;应用Blast方法分析该蛋白氨基酸序列与人类蛋白序列的相似性;分别用BIMAS量化基序法、NetCTL法和SYFPEITHI超基序法预测蛋白的CTL表位;分别用SYFPEITHI超基序法和RANKPEP法远程预测Th细胞表位,从中筛选表位较集中、得分较高者作为候选多肽片段。应用TMHMM软件对蛋白进行跨膜预测,使用PSORT version软件进行蛋白的细胞内定位,应用SignalP软件2.0和SignalP 4.0 Server进行信号肽分析。构建表达Rv2657c重组蛋白(r Rv2657c)的大肠杆菌(E.coli)工程菌,然后诱导rRv2657c蛋白表达,继而纯化rRv2657c蛋白。通过蛋白免疫印记法(Western blot)及酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)方法初步研究其免疫学特性,其中ELISPOT检测,以早期增殖期蛋白---培养滤过蛋白10和早期分泌抗原靶6重组融合蛋白(CFP10-ESAT6,CE)为对照,以rRv2657c刺激健康防痨工作人群和活动性结核病人群的外周血单个核细胞,检测分泌γ干扰素的效应T淋巴细胞斑点数(SFCs),比较其在不同人群里的差别。Protean软件预测结果表明Rv2657c蛋白亲水性、柔韧性及抗原性较好,表面可及性较弱,α螺旋和β折叠数量较多且分布范围广泛,卷曲、转角结构少,有5个B细胞表位,表位总长度占蛋白氨基酸全长的50%,主要集中在第14位氨基酸之后;预测该蛋白有6个T细胞表位,表位总长度占蛋白氨基酸全长的38.4%,主要集中在第10位氨基酸之后。BIMAS量化基序法、NetCTL法、和SYFPEITHI超基序法预测该蛋白有6个CTL表位,其中以HLA-A2限制性表位数目较多,得分较高;SYFPEITHI超基序法和RANKPEP法预测该蛋白有38个Th表位,其中以HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701表型表位数目较多。TMHMM软件、PSORT version软件、SignalP软件2.0和SignalP 4.0 Server预测Rv2657c蛋白是一个无信号肽,不分泌的胞浆蛋白。我们成功构建了表达rRv2657c蛋白的E.coli工程菌,并获得了纯化的蛋白。Western Blot实验结果显示rRv2657c蛋白与结核潜伏感染豚鼠血清反应结果为阳性,健康对照组反应结果为阴性。ELISPOT实验结果显示rRv2657c蛋白在健康防痨工作人员组的SFCs值(11)明显高于活动性结核病组(1.5)(p0.05)。综上所述,Rv2657c蛋白是一个既有B细胞表位也有T细胞表位的抗原,以B细胞表位占优势。重组Rv2657c蛋白分子量为12.8kDa,以可溶性及包涵体两种形式表达,但以可溶性表达为主,采用金属离子亲和层析方法纯化,通过超滤法浓缩蛋白。纯化获得的rRv2657c蛋白在Western Blot试验中证明其有较好的抗原性;在Elispot试验中证明其有较好的免疫原性,有可能成为潜伏感染诊断的标志物。
[Abstract]:缁撴牳鐥呮槸缁撴牳鍒嗘灊鏉嗚弻(Mycobacterium tuberculosis,MTB)寮曡捣鐨勪紶鏌撶梾,涓昏閫氳繃鍛煎惛閬撲紶鎾,

本文编号:1698776

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