片仔癀灌胃治疗多发性硬化模型鼠的疗效评价研究及初步机制探索

发布时间：2018-04-09 17:29

  本文选题：实验性自发性脑脊髓炎　切入点：多发性硬化　出处：《西南交通大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:本研究通过片仔癀灌胃治疗多发性硬化(multiple sclerosis,MS)模型鼠一实验性自发性免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE))大鼠模型和小鼠模型,并对其进行疗效评价研究及初步探索可能的治疗机制,为临床片仔癀用于治疗MS提供实验依据。方法:1.雄性Lewis大鼠左后足垫皮下注射豚鼠髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)诱导急性EAE模型。随机分为正常组(Normal)、模型组(Model)、醋酸泼尼松组(PA,5 mg/kg/d)、片仔癀低剂量组(PZH-L,0.054 g/kg/d)、片仔癀中剂量组(PZH-M,0.162 g/kg/d)、片仔癀高剂量组(PZH-M,0.486 g/kg/d),于免疫10天后灌胃给药21天,非药物组给予等量双蒸水干预。药物治疗期间,每天对小鼠体重和临床症状进行观察和记录,进行神经功能评分。苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)和髓鞘染色法(luxolfastblue,LFB)检测大鼠大脑、脑干和脊髓组织的病理变化;ELISA法检测血清中炎症因子IL-17A、IL-23的含量变化和CCL3和CCL5趋化因子的表达水平。2.采用髓鞘磷脂蛋白 139-151(proteolipid protein 139-151,PLP139-151)多肽免疫雌性SJL/J小鼠建立稳定的复发-缓解型EAE小鼠模型。小鼠随机分为正常组(Normal)、模型组(Model)、片仔癀低剂量组(PZH-L,0.078 g/kg/d)、片仔癀中剂量组(PZH-M,0.234 g/kg/d)、片仔癀高剂量组(PZH-H,0.702 g/kg/d)和醋酸泼尼松组(PA,7 mg/kg/d)共六个小组,每组10只小鼠。于免疫后第10天(发病点)开始每天以0.2 ml/20g的灌胃体积,灌胃给药60天,空白组和模型组给予等量的双蒸水干预。药物治疗结束后,采用LFB和HE染色法观察小鼠髓鞘脱失和炎症病理变化情况;选用免疫组织化学法检测大脑中MBP蛋白含量和少突胶质细胞转录因子2(Oligodendrocyte transcription factor2,olig2)含量;使用 ELISA 法检测小鼠血清中 IL-17A、TNF-α、IL-1β 和 IFN-γ炎性细胞因子的表达;利用细胞流式术检测CNS和脾中Th1和Th17细胞亚群的数量变化;运用Western blot法检测小鼠大脑中IKBα和P65的含量以及STAT1、STAT3、STAT4、P65和IKBα的磷酸化水平;采用Real-timePCR法检测小鼠脑中与Th1和Th17细胞相关的T-bet和ROR-γt转录因子的表达及IL-12a、IFN-γ、IL-17A和IL-22细胞因子的mRNA相对表达水平。结果:1.片仔癀对EAE大鼠的疗效结果:HE染色结果显示,模型组大鼠大脑、脑干和脊髓中可见小血管周围炎性细胞浸润并形成典型的"袖套状"改变,各治疗组大鼠这三个部位病理变化有不同程度的减轻,小静脉血管周围袖套样淋巴细胞浸润减少;ELISA检测显示,模型组大鼠血清中细胞因子IL-17A、IL-23、CCL3和CCL5表达显著升高,醋酸泼尼松组和片仔癀各剂量组这四个因子的表达明显降低,与模型组相比有显著性差异(P0.05 或P0.01)。2.片仔癀对EAE小鼠的疗效结果:和模型组相比,小鼠临床症状和神经功能评分显示片仔癀各剂量组和激素组能有效缓解小鼠疾病严重程度,减少复发次数(P0.05或P0.01);组织病理学结果表明,模型组小鼠有明显的炎性细胞血管"袖套样"浸润以及脊髓脱髓鞘等病变损伤,片仔癀能够有效减轻炎症反应和病理损伤(P0.05或P0.01);免疫组化结果显示,片仔癀药物治疗组能够增强小鼠脑中MBP和olig2阳性细胞信号(P0.05或P0.01);ELISA结果亦表明,片仔癀各治疗组能够大幅度抑制小鼠血清中IL-1β、IL-17A、TNF-α和IFN-γ细胞因子的表达(P0.05或P0.01)。3.片仔癀治疗EAE小鼠的机制研究结果:细胞流式结果表明,和模型组相比,片仔癀能分别降低CNS和脾中Th1和Th17细胞数量,具有显著性差异(P0.05或P0.01);Western Blot结果表明片仔癀能减少磷酸化的STAT1、STAT3、STAT4、P65和IKBα的蛋白表达水平(P0.05或P0.01);Real-time PCR结果显示,片仔癀能降低小鼠大脑中转录因子T-bet和ROR-γt的mRNA相对表达水平(P0.05或P0.01),以及能减少细胞因子IFN-γ、IL-12a、IL-17A和IL-22的mRNA的表达(P0.05或P0.01)。结论:1.片仔癀可以通过抑制炎症对EAE大鼠起到一定的治疗作用;2.片仔癀可通过减轻炎症和减少髓鞘脱失等对EAE小鼠起到一定的治疗作用;3.片仔癀对EAE小鼠的治疗作用,可能通过调控Th1和Th17细胞的分化和活性发挥作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5;R-332

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本文编号：1727426