抗人CD19单链抗体二价及四价多聚体的改建及功能研究

发布时间：2018-04-11 20:18

本文选题：靶向治疗 + CD19　；参考：《浙江大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景及目的：据报道,我国每年新发生的小儿恶性肿瘤达3万例,其中1/3为白血病。特别是急性白血病已成为威胁儿童生命健康的第一位恶性肿瘤。随着诊疗水平的提高及治疗方案改进,目前中国儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)完全缓解(CR)率已达95%以上,5年生存率已提高到80%以上¨。但白血病耐药和复发情况仍是目前影响白血病患者预后的重要原因。从分子和基因水平寻找新的作用靶点,在此基础上设计特异的靶向药物,这将为ALL的个体化治疗提供独特手段。肿瘤靶向治疗是定向对靶细胞进行特异性杀伤。通过与靶细胞表面特异性分子标志结合而直接作用于靶细胞,从而不影响正常组织细胞的功能。其中以抗体的靶向治疗研究得最为深入。CD19是继CD20之后B细胞恶性肿瘤免疫治疗引人瞩目的另一个分子靶点,因为它只在正常或恶性B淋巴细胞表面表达,几乎不在其他组织表达；且在B细胞恶性转化过程中不丢失。其特异性和稳定性使其作为一个理想的靶点受人关注。我院自主研制的ZCH-4-2E8(抗人CD19)抗体为鼠源的IgM抗体,前期研究显示其可靶向B系白血病细胞。本实验室在亲本2E8抗体的基础上已成功构建人鼠嵌合单链抗体scFv2E8-Fc。功能试验显示,改造后的scFv2E8-Fc抗体与亲本2E8抗体相比,与抗原结合的亲和力明显降低。国外研究表明,抗体多价化后由于其抗原结合位点的增多和分子量的增大,其亲和力较单价抗体会有明显提高。因此,本研究在前期研究的基础上,通过基因工程技术构建抗人CD19的二价及四价抗体,并进行后续的体外及体内功能试验研究。本研究主要由以下几个部分组成：1、构建抗人CD19的二价及四价抗体真核表达载体。2、二价及四价多聚体蛋白在真核细胞中华仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)细胞中的表达及体外功能研究。3、建立血液系统恶性肿瘤动物模型,检测多价抗体的体内治疗作用。方法：1单链抗体scFv2E8及其双价抗体diascFv2E8真核表达载体的构建1.1单链抗体pcDNA3.1/scFv2E8真核表达载体的构建以能够持续分泌scFv2E8-Fc融合蛋白并已成功建株的pcDNA3.1-scFv2E8-FcCHO细胞作为目的细胞,采用RT-PCR法钓取细胞中scFv2E8目的基因,克隆至pcDNA3.1质粒中,构建单链抗体pcDNA3.1/scFv2E8真核表达载体。1.2 pcDNA3.1/Fc-6×his真核表达载体的构建以本实验室前期已成功构建的pcDNA3.1/Fc质粒为模板,针对Fc基因片段设计引物进行PCR,通过引物在Fc段下游引入6xhis标签,并在基因序列的5’和3’端分别引入EcoR I和Xba I酶切位点。构建中间载体pcDNA3.1/Fc-6xhis.1.3双价抗体pcDNA3.1/diascFv2E8真核表达载体的构建以pcDNA3.1/scFv2E8质粒作为模板,设计引物,通过SOE-PCR的方法扩增"VH2E8-linker5-VL2E8"目的基因片段,将VH2E8与VL2Es之间的连接肽(linker)缩短为五个氨基酸的G4S,并且在VL2E8基因的末端引入6xhis标签和终止子TAG,并将其克隆至pcDNA3.1载体,构建双价抗体真核表达载体pcDNA3.1/diascFv2E8.2 pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53两种四价多聚体真核表达载体的构建2.1 四价抗体pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc真核表达载体的构建将二价抗体真核表达载体pcDNA3.1/diascFv2E8相应酶切位点之间的基因片段VH2E8-linker5-VL2E8平行克隆至中间载体pcDNA3.1/Fc-6xhis上,通过两个Fc段之间的二硫键的偶联,构建四价抗体的真核表达载体pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc.2.2四价抗体Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53真核表达载体的构建以pcDNA3.1/scFv2E8质粒为模板,设计引物扩增scFv2E8基因片段,并在其两端引入Hind Ⅲ和BamH I酶切位点。全基因合成P53-hinge-hisx6片段,通过一段连接肽(人IgG3上游铰链区)将其与单链scFv2E8基因片段相连。通过P53四聚化结构域指导scFv2E8蛋白自动组装为四聚体,构建四价抗体真核表达载体Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53.3二价diascFv2E8和四价diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚体蛋白的表达和功能测定3.1二价diascFv2E8和四价diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚体蛋白的真核细胞表达抽提转染级质粒pcDNA3.1/diascFv2E8、pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53,转染真核细胞CHO。转染后G418持续加压筛选,流式细胞术鉴定各转染细胞培养上清中是否存在有活性的二价及四价重组蛋白。通过有限稀释法亚克隆相应阳性细胞株,收集其上清中的蛋白。通过Millipore超滤管20：1超滤浓缩收集上清,Ni-IDA亲和层析法纯化带有6xhis标签的重组蛋白。改良Marshall法制备2E8-FITC直标抗体。3.2二价diascFv2E8和四价diascFv2E8-Fc、scFv2E8-P53多聚体蛋白的功能研究利用上述浓缩纯化的二价及四价重组蛋白进行如下功能研究：BCA法测定重组蛋白的浓度；流式细胞术检测三种重组蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的滴定实验；流式细胞术检测三种重组蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53对2E8-FITC直标抗体的阻滞作用；RT-PCR检测CHO/diascFv2E8、 CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53细胞中的目的基因的表达；细胞免疫荧光法鉴定重组蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53;竞争性结合实验鉴定四种抗体scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的相对亲和力；流式细胞术检测四种抗体scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的内化特性；四种抗体scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的解离率实验；scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53抗体诱导的凋亡作用；比较人鼠嵌合抗体scFv2E8-Fc和四价抗体diascFv2E8-Fc的.ADCC、CDC作用；SDS-PAGE和Western-Blot检测细胞培养上清中重组蛋白的表达。4多价抗体的血液系统肿瘤动物模型体内治疗作用研究通过对重症联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID小鼠)的尾静脉注射Raji细胞,建立伯基特淋巴瘤动物模型。小鼠随机分组进行治疗,共分为6组：PBS空白对照组、造模组、scFv2E8抗体治疗组、diascFv2E8抗体治疗组、diascFv2E8-Fc抗体治疗组和scFv2E8-P53抗体治疗组。上述各抗体治疗组分别于Raji细胞注射一周后,通过尾静脉注射各纯化的抗体50μg/只,连续3天。密切观察小鼠的状况,定期测量小鼠体重,以后肢瘫痪为发病标准。记录发病及死亡日期,绘制生存曲线。颈椎脱臼法处死濒死小鼠,取各脏器做石蜡包埋切片,行HE染色和免疫组化检查。结果：1单链抗体scFv2E8及其双价抗体diascFv2E8真核表达载体成功构建1.1单链抗体pcDNA3.1/scFv2E8真核表达载体成功构建以pcDNA3.1-scFv2E8-Fc CHO细胞作为模板,RT-PCR成功扩增scFv2E8目的基因,切胶回收目的基因产物TA克隆至pGEM(?)-T easy载体,将pGEM-T/scFv2E8载体上的目的基因片段采用EcoR I和BamH I双酶切平行克隆至pcDNA3.1载体,测序证实pcDNA3.1/scFv2E8质粒构建成功。1.2 pcDNA3.1/Fc-6xhis真核表达载体成功构建通过PCR成功扩增目的基因片段Fc-6xhis,切胶纯化回收后TA克隆至pGEM(?)-T easy载体,将pGEM-T/Fc-6×his载体上的目的基因片段采用EcoR I和Xba I双酶切平行克隆至pcDNA3.1载体,测序证实pcDNA3.1/Fc-6×his中间载体构建成功。1.3双价抗体pcDNA3.1/diascFv2E8真核表达载体成功构建SOE-PCR成功扩增目的基因片段VH2E8-linker5-VL2E8 (810bp),切胶回收目的基因产物TA克隆至pGEM(?)-T easy载体,将pGEM-T/VH2E8-linker5-VL2E8载体上的目的基因片段采用BamH I和EcoR I双酶切平行克隆至pcDNA3.1载体,测序证实pcDNA3.1/diascFv2E8载体构建成功。2 pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53两种四价抗体真核表达载体成功构建2.1 四价抗体pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc真核表达载体成功构建分别用BamHI和EcoR I对pcDNA3.1/diascFv2E8和pcDNA3.1/Fc-6xhis质粒进行双酶切,切胶回收目的基因片段diascFv2E8和载体pcDNA3.1/Fc-6xhis,两者按3：1摩尔比成功连接,测序证实pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc质粒构建成功。2.2四价抗体Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53真核表达载体成功构建PCR成功扩增scFv2E8基因片段,切胶回收目的基因产物TA克隆至pGEM(?)-T easy载体。全基因合成P53-hinge-his×6基因片段(213bp),成功构建pcDNA3.1/P53-hinge-his×6质粒。将pGEM-T/Hind III-scFv2E8-BamH I载体上的单链scFv2E8基因平行克隆至pcDNA3.1/P53-hinge-hisx6载体。测序证实Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53质粒构建成功。3二价diascFv2E8和四价diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚体蛋白的成功表达及功能测定3.1 二价diascFv2E8和四价diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚体蛋白在真核细胞CHO中成功表达pcDNA3.1/diascFv2E8, pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53转染级质粒抽提成功。上述质粒转染CHO细胞后,以6418 600μg/ml加压稳定转染。流式检测发现转染细胞CHO/diascFv2E8、CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53的培养上清中均存在有活性的能识别Raji细胞上CD19抗原的重组多聚体蛋白。经过3次亚克隆后,转染细胞CHO/diascFv2E8、CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53均已成功建株。收集上清中相应蛋白并已浓缩纯化。改良Marshall法成功制备2E8-FITC直标抗体。3.2二价diascFv2E8和四价diascFv2E8-Fc、scFv2E8-P53多聚体蛋白的功能研究BCA法测重组蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc 和 scFv2E8-P53浓度分别为0.210mg/ml、0.231mg/ml和0.177mg/ml;滴定实验显示,饱和lx106Raji细胞分别需要diascFv2E8、diascFv2E8-Fc、scFv2E8-P53和2E8-FITC抗体的量为2.1μg、 1.5μg、2.0μg和1.5μg；阻滞实验发现,多价抗体对亲本2E8的阻滞作用均优于单价抗体,且四价抗体diascFv2E8-Fc效果最佳；RT-PCR检测发现各目的基因已成功转染至CHO真核细胞；细胞免疫荧光法检测发现转染细胞CHO/diascFv2E8、 CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53胞浆内均可见清晰的绿色荧光,说明上述三种转染细胞均已成功表达融合蛋白；通过竞争结合实验计算scFv2E8、 diascFv2E8、scFv2E8-P53和diascFv2E8-Fc蛋白的相对亲和力常数为：1×1010M-1、 4×1010M-1、1.6×1011M-1和4×1011M-1；内化实验显示,二价抗体diascFv2E8较单价抗体scFv2E8内化快。但两种四价抗体diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53蛋白内化率与单价scFv2E8相比没有明显差异；解离率实验显示四价抗体的解离速率明显低于双价及单价抗体；凋亡实验显示：四价抗体diascFv2E8-Fc诱导的凋亡作用最强,优于二价抗体diascFv2E8,单价scFv2E8抗体几乎没有促凋亡的作用；四价抗体diascFv2E8-Fc的ADCC作用强于scFv2E8-Fc抗体；在抗体高浓度时(50μg/ml, 25μg/ml),四价抗体diascFv2E8-Fc的CDC作用强于scFv2E8-Fc抗体；SDS-PAGE和Western Blot结果显示,diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53蛋白产物均以混合体的形式存在。4多价抗体的血液系统肿瘤动物模型体内治疗作用研究伯基特淋巴瘤动物模型建立成功；发病小鼠出现体重下降,后肢瘫痪,并伴有脊柱侧弯、弓背、呈恶病质；HE染色和免疫组化(抗人CD19抗体标记)检测结果显示,发病小鼠脑膜均有肿瘤细胞浸润,免疫组化染色可见褐黄色肿瘤细胞浸润脑膜；生存分析显示,各组间的生存时间差异具有统计学意义(p0.05)。四价抗体在体内治疗作用优于二价及单价抗体,尤以四价抗体diascFv2E8-Fc的体内治疗效果最好。结论：1、二价抗体pcDNA3.1/diascFv2E8及两种四价抗体pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53真核表达载体构建成功。2、二价diascFv2E8和四价diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚体蛋白在真核细胞CHO中成功表达。这些多价抗体都能够识别表达CD19抗原分子的Raji细胞。3、体外功能试验显示：四价抗体的亲和力显著优于二价及单价抗体,尤以四价抗体diascFv2E8-Fc的亲和力最强；四价抗体的解离速率明显低于双价及单价抗体,半衰期延长,可以在体内更好地发挥作用；多价抗体能引起明显的诱导肿瘤细胞凋亡的作用；四价抗体diascFv2E8-Fc的ADCC和CDC作用强于人鼠嵌合单链抗体scFv2E8-Fc,提示多价抗体可以通过CDC、ADCC作用和诱导肿瘤细胞凋亡更好地靶向杀伤肿瘤细胞。4、伯基特淋巴瘤动物模型建立成功；体内功能试验显示,四价抗体在小鼠体内治疗作用优于二价及单价抗体,尤以四价抗体diascFv2E8-Fc的体内治疗效果最好。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

【参考文献】