miR-196b-5p慢病毒载体的构建及其对脂肪细胞和成骨细胞分化的影响

发布时间：2018-04-14 06:39

本文选题：微小RNA + 间充质干细胞　；参考：《天津医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:MicroRNAs(miRNAs)是一类长约22nt的内源性非编码RNA,通过与靶基因mRNA完全或部分配对而降解靶基因mRNA或抑制其翻译,从而在转录后水平调控靶基因的表达,参与细胞分裂、细胞分化、细胞凋亡、新陈代谢和癌症等一系列生物学过程。许多研究表明miRNAs在间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)成脂/成骨分化的过程中有重要调节作用。本研究主要探讨miR-196b-5p对脂肪细胞和成骨细胞分化的影响,并初步探讨其作用机制。方法:1、利用qRT-PCR检测小鼠BMSCs和骨髓基质细胞系ST2向脂肪细胞和成骨细胞分化过程中miR-196b-5p表达量的变化。2、构建miR-196b-5p过表达慢病毒质粒miR-196b-5pLV和抑制性慢病毒质粒miR-196b-5pspong,并用293T细胞包装慢病毒颗粒。3、用miR-196b-5p过表达和抑制性慢病毒感染小鼠BMSCs和ST2后进行成脂诱导,利用qRT-PCR、WesternBlotting、油红O染色等技术检测miR-196b-5p对成脂分化的影响;进行成骨诱导,利用qRT-PCR、WesternBlotting和ALP染色等技术检测miR-196b-5p对成骨细胞分化的影响。4、利用靶基因预测软件预测miR-196b-5p的靶基因,构建靶基因Tgfbr1-3′UTR荧光素酶报告基因载体,利用双荧光素酶报告基因技术鉴定靶基因;ST2细胞中转染miR-196b-5pmimics和miR-196b-5pinhibitor后检测蛋白TGFBR1的表达量;miR-196b-5pmimics与Tgfbr1共转进行细胞拯救实验。5、采用4周龄雄性C57BL/6J小鼠,高脂饲料喂养构建小鼠肥胖模型,同时尾静脉注射miR-196b-5psponge慢病毒及其阴性对照病毒,造模过程中记录各组小鼠体重,造模成功后称量腹股沟脂肪和附睾脂肪重量,qRT-PCR检测附睾脂肪成脂分化相关特异性基因mRNA表达变化,检测血清中葡萄糖、胰岛素、甘油三酯、游离脂肪酸水平,以此确定miR-196b-5psponge慢病毒对肥胖的影响。结果:1、miR-196b-5p在小鼠BMSCs和骨髓基质细胞系ST2成脂诱导后表达量上升,成骨诱导后表达量下降。2、成功构建了miR-196b-5p过表达慢病毒质粒miR-196b-5pLV和抑制性慢病毒质粒miR-196b-5psponge。3、用miR-196b-5pLV感染小鼠BMSCs和ST2细胞并进行成脂诱导后,油红O染色显示过表达miR-196b-5p能促进其分化为成熟脂肪细胞,qRT-PCR和WesternBlotting结果显示成脂相关特异性基因PPARγ、C/EBPα、aP2和adipsin的表达均上调,相反,miR-196b-5psponge感染小鼠BMSCs和ST2细胞会抑制其向脂肪细胞分化;miR-196b-5pLV感染小鼠BMSCs和ST2细胞进行成骨诱导后,ALP染色减弱,显示miR-196b-5p抑制细胞向成骨细胞分化,qRT-PCR和WesternBlotting结果显示成骨分化相关转录因子Osterix、Runx2、成骨细胞表征因子碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)、Osteocalcin(Oc)和骨涎蛋白(BoneSialoprotein,Bsp)的表达下调,相反,miR-196b-5psponge感染小鼠BMSCs和ST2细胞会促进其成骨分化。4、miR-196b-5pmimics和Tgfbr1-3′UTR共转染AD293细胞后荧光素酶活性显著下;转染miR-196b-5pmimics后蛋白TGFBR1的表达量下降,转染miR-196b-5pinhibitor后蛋白TGFBR1的表达量上调;miR-196b-5pmimics能拯救Tgfbr1对ST2细胞的抑制成脂分化作用。5、饲喂高脂饲料组小鼠较饲喂普通饲料组小鼠体重明显上升,造模成功,高脂饲料喂养同时尾静脉注射miR-196b-5psponge慢病毒组体重较高脂模型组体重下降,腹股沟脂肪和附睾脂肪重量减轻,qRT-PCR检测附睾脂肪成脂相关特异性基因PPARγ,C/EBPα,aP2和adipsin的表达水平均低于高脂模型组,血清中葡萄糖、胰岛素、游离脂肪酸和甘油三酯水平也下降。结论:1、miR-196b-5p在小鼠BMSCs和ST2细胞成脂分化过程中表达量上调,而在成骨分化过程中表达量下调。2、miR-196b-5pLV慢病毒能促进小鼠BMSCs和ST2细胞成脂分化,抑制其成骨分化;而miR-196b-5psponge慢病毒能抑制小鼠BMSCs和ST2细胞成脂分化,促进其成骨分化。3、miR-196b-5p可能通过靶向抑制Tgfbr1的表达来促进脂肪细胞分化。4、miR-196b-5psponge慢病毒能缓解小鼠血清中高脂饮食导致的生化指标紊乱,提高胰岛素敏感性,抑制脂肪细胞体积增大,抑制肥胖的产生。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of miR - 196b - 5p on the differentiation of osteoblast and osteoblast by means of qRT - PCR , Western Blotting and ALP staining . The results showed that miR - 196b - 5pacts inhibited the differentiation of bone marrow cells into adipogenic cells .

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R3416

【参考文献】