EV71全病毒灭活疫苗免疫机制的系统生物学研究

发布时间：2018-04-15 15:09

  本文选题：手足口病 + 肠道病毒71型　； 参考：《吉林大学》2016年博士论文

【摘要】：EV71属于微小病毒科肠道病毒属,是手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)的主要病原体之一。EV71病毒具有强的嗜神经性,能够诱发包括脑炎(encephalitis)、无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)等神经系统疾病,严重者可导致死亡,因此被认为是后脊髓灰质炎时代最危险的神经毒性肠道病毒。EV71病毒在全球范围内流行,在发展中国家(特别是亚太地区)尤其严重。目前临床上尚无治疗EV71感染的特效药物,安全高效的疫苗被认为是控制EV71流行的最有效手段。目前多个国家和地区的疫苗研发机构均开展了EV71疫苗的研发工作,其中中国大陆三家企业研发的EV71全病毒灭活疫苗进展最快,已完成III期临床试验。临床结果显示,该疫苗对EV71引起的手足口病保护率在90%以上,对EV71病毒引起的其他疾病保护率在80%以上。其中两家疫苗已在2015年底率先通过中国食品药品监督管理总局批准上市。但由于EV71疫苗为全新疫苗,对该疫苗免疫机制了解尚不清楚。探讨疫苗的免疫机制,对疫苗上市后再评价以及指导新疫苗的研发均具有重要意义。传统疫苗研发主要依赖经验为主,缺乏对疫苗免疫机制的探讨,这可能是传统疫苗学手段在新型疫苗如:HCV、HIV等疫苗的研发中遭遇瓶颈的主要原因。2009年国外学者首次将系统生物学手段应用于疫苗研究中,提出了系统疫苗学的概念,将高通量检测技术以及计算机模型分析数据方法与传统疫苗学研究相结合,并率先应用于HPV、黄热、流感等疫苗的研究中,揭示了疫苗接种后,激活的信号转导与免疫调节路径,筛选了与疫苗免疫效果和免疫持久性相关的基因预测标志物。本研究首先采用Meta分析方法对多个独立的系统疫苗学研究获得的转录组数据进行整合分析,获得不同疫苗接种早期激活的共同基因与通路,并在EV71疫苗受试者中进行验证。为了进一步探讨EV71疫苗诱导的特异性免疫应答,我们采集EV71疫苗临床受试者的PBMC样本作为研究对象,运用芯片技术检测EV71疫苗接种后转录组水平变化情况,并比较了该疫苗初次应答与再次应答的异同。转录组数据显示TLR下游基因与通路在EV71疫苗接种后存在活化现象,因此我们在动物体内体外水平分别探讨了TLR在EV71疫苗免疫应答中的功能,首次发现疫苗纯化过程中残留的sf-DNA对TLR9通路的激活作用。第一部分:通过Meta分析探讨疫苗接种早期共同应答机制系统生物学手段已成功应用于HPV、黄热、流感等疫苗的研究中,但由于不同研究使用的芯片平台不同,分析方法不统一,结果差异较大,难以发现规律性结果。Meta分析通过对不同研究的原始资料进行统一标准汇总再分析,达到扩大样本量以及整合分析的目的,帮助我们发现疫苗免疫应答的共同机制。本研究中,我们检索并下载了NCBI、GEO和Array Express数据库中与疫苗免疫相关的基因芯片表达谱数据,根据统一的入组排除标准,共5篇文献涉及7个疫苗的研究数据进入了后续分析。分析结果表明疫苗接种早期诱导的共同基因和通路为IFN-I相关的基因和通路。该发现在EV71疫苗免疫人群中通过Q-PCR方法得到了验证。疫苗接种早期共同免疫机制的发现,不仅为后续EV71疫苗特异性免疫机制的研究提供了基础,同时对疫苗免疫原性早期预测指标的筛选提供了重要的指导意义。第二部分:EV71疫苗诱导的初次免疫应答与再次应答比较研究为探讨EV71疫苗特异的免疫应答作用,我们使用系统疫苗学方法对接种EV71疫苗受试者的PBMC样本开展研究。鉴于大多数疫苗免疫相关的基因芯片表达谱研究仅关注疫苗首次接种后诱导的初次免疫应答,对于再次接种诱导的记忆应答知之甚少,而再次应答又与抗体滴度以及免疫持久性直接相关,因此本研究同时关注了EV71疫苗诱导的再次应答机制,并与初次免疫应答机制进行了比较。本部分研究共筛选了19例免前EV71中和抗体阴性健康儿童入组,并分别采集其接种EV71疫苗前后的PBMC样本。以EV71疫苗原液体外刺激免前阴性样本PBMC作为初次免疫应答,以原液体外刺激接种后阳转样本PBMC作为再次应答,转录组谱的变化采用全基因组芯片进行检测。结果显示初次应答与再次应答均激活IRF7调节的I型干扰素与抗病毒应答网络,此外在记忆应答中上调基因还包括IRF1调节的T细胞活化相关基因、炎症相关基因、B细胞活化以及体液免疫相关基因。细胞因子谱显示IL-10在初次免疫应答时显著上调,而IL-2,IP-10,CCL14a,CCL21在记忆应答时显著上调,与转录组上调基因功能一致。MX1和IP-10与免后180d中和抗体水平具有较高相关性,可以作为预测EV71抗体持久性的潜在指标。第三部分:小片段DNA激活TLR9促进EV71疫苗体液免疫Meta分析与转录组数据均显示,EV71疫苗接种后能够激活I型干扰素信号通路,而I型干扰素信号通路上游为TLRs。此外许多研究表明不同类型疫苗均能激活特异的TLR,且位于TLR基因上的SNP位点可能与疫苗低应答或无应答现象相关。因此我们推测TLR可能同样参与EV71灭活疫苗免疫应答过程。本部分研究在小鼠水平比较了TLR4与TLR9在对EV71灭活疫苗原液免疫应答过程中的功能。研究结果显示TLR4和TLR9在对EV71疫苗原液免疫应答过程中均出现表达上调现象,且与抗原量存在量效关系。受TLR4与TLR9信号通路调节的细胞因子分泌水平上调以及TLR4与TLR9基因敲除小鼠接种EV71疫苗后中和抗体水平下降,均证实TLR4与TLR9在EV71疫苗应答中发挥重要作用。进一步研究发现残留的sf-DNA是激活TLR9的主要原因,在EV71疫苗原液中定量添加sf-DNA,能够提高疫苗接种后的体液免疫水平。本研究是首次对TLR在EV71灭活疫苗中免疫功能进行了探讨,也是首次对残留宿主sf-DNA的免疫功能进行了报道。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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