肺炎链球菌疫苗蛋白ΔA146Ply的矿化纳米颗粒制备及其保护效应评价

发布时间：2018-04-14 22:44

本文选题：肺炎链球菌 + 蛋白疫苗　；参考：《重庆医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)是在全球范围内引起侵袭性细菌性疾病的主要原因之一,疫苗是控制其感染致病的有效手段。由于临床使用疫苗的局限性,有必要开发一种具备诱导强免疫应答能力且低毒副作用的新型疫苗。蛋白疫苗由于其保守性高,制备简单,能激活有效B、T细胞免疫,是目前疫苗研发的热点类型。但单独的蛋白免疫原性不够高,需要添加佐剂辅助免疫。而有研究表明,纳米颗粒形式的疫苗能诱导更强的免疫反应。因此,本研究拟使用生物矿化肽PA44、NW、N6、W6将肺炎链球菌蛋白ΔA146Ply制备为矿化纳米颗粒,并通过观测其免疫保护效果及安全性以评价该方法的应用价值。方法:通过分子克隆技术表达含生物矿化肽的疫苗蛋白ΔA146Ply-PA44、ΔA146Ply-NW、ΔA146Ply-N6、ΔA146Ply-W6以及ΔA146Ply,并纯化、去内毒素。利用冯库萨染色确定蛋白ΔA146Ply-PA44,ΔA146Ply-NW,ΔA146Ply-N6,ΔA146Ply-W6具备螯合磷酸钙的能力。在富含Ca2+和PO43-的弱碱性溶液中,蛋白ΔA146Ply-PA44、ΔA146Ply-NW、ΔA146Ply-N6、ΔA146Ply-W6通过螯合磷酸钙发生矿化,使用透射电镜(TEM)、X射线光电子能谱(XPS)等对矿化产物进行分析。将可溶性蛋白ΔA146Ply、ΔA146Ply-PA44、Δa146ply-nw、Δa146ply-n6、Δa146ply-w6及其矿化纳米颗粒分别刺激体外培养的小鼠骨髓来源树突状细胞(bmdcs),通过分泌细胞因子的情况来评估纳米颗粒对抗原提呈的影响。将上述可溶性蛋白和矿化纳米颗粒分别经皮下免疫小鼠,采用elisa检测抗体效价、脾细胞因子,末次免疫后构建败血症模型及肺炎模型,观测小鼠生存率、肺部定植、肺部炎症等以评价矿化纳米颗粒的保护效应。通过溶血实验、免疫动物的体重变化、免疫位点结节/肿块观察等实验评估矿化纳米颗粒的安全性。结果:成功制备蛋白Δa146ply-pa44,Δa146ply-nw,Δa146ply-n6,Δa146ply-w6,Δa146ply,纯度达到90%以上。蛋白Δa146ply-pa44,Δa146ply-nw,Δa146ply-n6,Δa146ply-w6具有螯合磷酸钙的能力,并可形成不同密度、直径的纳米颗粒(Δa146ply-pa44@cap、Δa146ply-nw@cap、Δa146ply-n6@cap、Δa146ply-w6@cap)。相较于Δa146ply,所有矿化蛋白纳米颗粒均可在体外刺激bmdcs分泌更高浓度的il-6和tnf-α,其中Δa146ply-pa44@cap和Δa146ply-nw@cap较其可溶性蛋白组刺激bmdcs产生的il-6和tnf-α水平显著增高。在体内实验中,所有矿化纳米颗粒免疫组较Δa146ply免疫组可产生更高的特异性抗体效价、脾细胞因子ifn-γ、il-4及il-17a,相较于其可溶性蛋白免疫组可诱导小鼠脾细胞分泌更多的il-4和il-17a,Δa146ply-pa44@cap、Δa146ply-nw@cap及Δa146ply-w6@cap免疫组相较于含铝佐剂的可溶性蛋白组可产生更高水平的il-4。Δa146ply-pa44@cap和ΔA146Ply-W6@CaP免疫组在败血症模型中展现出可比拟阳性对照(PPV23)的保护效果。所有矿化纳米颗粒免疫组在肺炎模型中均呈现较可溶性蛋白免疫组及含铝佐剂的可溶性蛋白免疫组更低的肺部定植以及更弱的肺部炎症浸润。安全性实验结果显示:所有实验所用的可溶性蛋白及矿化纳米颗粒均不引起溶血,各免疫组小鼠体重变化没有差异,免疫结束后各重要器官重量无差异,使用矿化纳米颗粒免疫后不会在免疫位点产生结节或肿块。结论:基于磷酸钙的矿化纳米颗粒可有效增强疫苗蛋白的抗原递呈,促进体液免疫和细胞免疫,增强疫苗蛋白对宿主的保护效应,甚至可与市售疫苗效果相当,且不存在免疫局部结节出现的情况,较铝佐剂的效应更好,是一种有价值的蛋白疫苗制剂发展方向。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

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