CRISPR-Cas9技术在B型血友病小鼠模型构建及治疗的应用研究

发布时间：2018-04-26 20:07

本文选题：CRISPR + Cas9　；参考：《华东师范大学》2016年博士论文

【摘要】：单基因遗传病是因为体内一个基因发生功能性突变而导致的。超过3000种人类疾病与单个基因突变相关。迄今为止,药物仍然无法根治单基因遗传病,基因治疗成为治疗单基因遗传病的最佳手段。传统的基因治疗手段依赖病毒载体向体内传递外源基因,从而替代体内有缺陷的基因行使功能,但是这一方法存在诸多缺点。近年来兴起的CRISPR-Cas9基因编辑技术因其操作简便、基因定点修饰效率高等特点,在基因治疗方面显示出巨大潜力。CRISPR-Cas9技术的作用原理是在向导RNA引导下,由Cas9核酸酶识别基因组特异位点并对其进行切割的过程。由于CRISPR-Cas9技术操作简便,效率高,已超越ZFNs与TALLEN成为基因编辑的首要工具,目前已被广泛应用于肿瘤、免疫、农作物等研究。CRISPR-Cas9技术发展的下一个目标将是能广泛在个体体内清除或修复各种遗传病致病基因的突变,从而达到缓解疾病病症的目的。B型血友病是基因治疗的理想模型,为此我们开展了CRISPR-Cas9技术在治疗单基因遗传病B型血友病的应用研究。我们首先根据B型血友病家系中发现的F9基因的新型突变(第371位酪氨酸突变为天冬氨酸)设计模拟该突变的血友病小鼠模型。发现人源F9基因的第371位酪氨酸位点在各物种间是高度同源的,在小鼠体内该位点位于F9基因的第381位氨基酸。通过向小鼠的一细胞期胚胎注射Cas9 mRNA,sgRNA与ssODN,成功构建了模拟病人新突变的点突变小鼠F9Y381D。同时还构建了模拟病人该位点已报导的F9Y381S突变小鼠,与第383位氨基酸突变为终止密码子的敲除小鼠F9Y38STOP。通过对F9Y38ID突变小鼠及另外两种突变小鼠进行活化凝血酶原时间与尾部凝血实验的测定,我们确定病人来源的F9基因的Y371D新型突变比已报导的Y371S突变具有更强的致病性。接着,我们利用构建好的血友病小鼠模型进行基因治疗的研究。通过流体动力学的注射方法向成体小鼠尾静脉注射用于表达Cas9蛋白与sgRNA的质粒,及用于同源重组的DNA(双链或单链)模板,以期修复肝脏细胞中F9基因的Y381D突变。发现经过注射治疗后的FqY38ID小鼠的活化凝血酶原时间缩短,尾部凝血实验的存活率提高,而且注射质粒并没有引起肝脏内的免疫反应。经过对肝脏细胞的测序分析,发现肝脏细胞内单链模板组有0.56%(或双链模板组有1.55%)的F9等位基因被修复,提示只要修复肝脏细胞内0.56%的F9基因即可缓解B型血友病的病情。为了提高肝脏细胞的基因修复率,我们引入感染能力更强的腺病毒载体。在向成体小鼠尾静脉注射表达Cas9蛋白,sgRNA及携带同源重组模板的腺病毒后,我们发现虽然腺病毒系统在肝脏细胞内修复了5.5%的F9基因,然而却没有缩短F9Y38ID小鼠的活化凝血酶原时间。通过对肝脏内转氨酶、炎症因子的检测、及肝脏细胞形态的观察,我们发现腺病毒系统会引起肝脏内剧烈的免疫反应,可能是导致腺病毒治疗无效果的原因。综上所述,我们的研究表明通过Cas9基因编辑技术原位修复F9基因突变治疗B型血友病的可行性,也为基因编辑技术应用于单基因遗传病的治疗提供了有力的实验支持。
[Abstract]:In recent years , the gene therapy has been widely used in the research of gene therapy . It has been widely used in the research of gene therapy .

【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R554.1;R-332

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