虚拟筛选用于铜绿假单胞菌群体感应抑制因子的探索

发布时间：2018-04-28 04:50

本文选题：虚拟筛选 + 群体感应　；参考：《华北理工大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的探索虚拟筛选用于铜绿假单胞菌群体感应抑制因子。方法1从PDB的网站上获取las R蛋白的三维结构文件,通过类药性评价筛选出天然产物,运用计算机分子对接手段进行基于靶标的虚拟筛选,从ZINC数据库中筛选对Las R蛋白具有活性作用的化合物,并对得分较高的化合物进行结合位点的预测。2临床标本送检培养,经病原菌种类鉴定,获取耐药性铜绿假单胞菌的临床分离株。3选定、购买目标化合物,对铜绿假单胞菌质控菌株及临床分离株以培养时间为横坐标,以600 nm处吸光度为纵坐标,绘制铜绿假单胞菌在不同浓度化合物作用下的生长曲线,筛选不影响铜绿假单胞菌生长的化合物,并选择适当浓度,确保后期活性影响鉴定实验的研究,都在不影响细菌生长的浓度范围内进行。4实时荧光定量PCR技术考察在加入目标化合物前后,铜绿假单胞菌质控菌株及临床分离株群体感应相关基因表达的变化。5检测目标化合物对铜绿假单胞菌质控菌株及临床分离株弹性蛋白酶、生物膜生成以及Swarming动力的影响。结果1从ZINC数据库的3500多万小分子中筛选出34种与Las R蛋白结合得分较高的化合物,预测得分最高的化合物是通过ASP129、THR142、CYS126、LYS130、ASN143和TRP41这几种关键氨基酸与靶蛋白产生氢键作用使得结合力较强。2从临床标本中分离选取一株多耐药性铜绿假单胞菌KQX13株。3选择购买A:ZINC02316089(STL038792)、B:ZINC00850552(STL327934)、C:ZINC01130988(STK135354)、D:ZINC31818910(STK655506)作为目标化合物,通过绘制生长曲线,B药、D药1600μM浓度范围,A药、C药在400μM浓度范围内不抑制铜绿假单胞菌质控菌株及临床分离KQX13株的生长,确定为后续实验浓度。4荧光定量PCR表明:A药在400μM浓度下,显著下调质控菌株毒力基因Las R,Las B及Lasl的表达;C药在同等摩尔浓度下,显著下调铜绿假单胞菌临床分离KQX13菌株毒力基因Las R,Las B及Lasl的表达;B药在较高的摩尔浓度(1600μM)下,与C药作用相似,并且表现出对KQX13菌株毒力基因Las R,Las B及Lasl的表达下调作用极为显著;四种化合物中,D药是唯一一个对菌株毒力基因起上调作用的化合物,显著上调质控菌株毒力基因Las R,Las B及Lasl的表达。5在铜绿假单胞菌质控菌株及KQX13菌株中加入A药、B药、C药弹性蛋白酶表达、生物被膜形成、Swarming表达都有所下降,加入D药弹性蛋白酶活性、Swarming动力活性在质控菌株中增强,弹性蛋白酶活性及生物膜形成能力在KQX13菌株中增强。结论1虚拟筛选技术应用于群体感应抑制因子的研究相较于高通量等其他筛选方法,大大减少了工作量,节约了成本,可以基于靶蛋白的结构进行数以百万计的大规模筛选且命中率较高,有望发现与靶蛋白结合力强的苗头化合物。2虚拟筛选得到的苗头化合物,需要由进一步的研究来确定作用的方向性。铜绿假单胞菌的群体感应系统是个十分复杂的网络体系,同一化合物作用下,不同的铜绿假单胞菌菌株的表现显著程度不同。
[Abstract]:A three - dimensional structure file of Pseudomonas aeruginosa was obtained from the site of PDB . The expression of Las B and Lasl was similar to that of C drug under the higher molar concentration ( 1600 渭M ) , and the expression of Las R , Las B and Lasl in strain KQX13 was significantly increased .

【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378

【参考文献】