亚基疫苗fHbp在大肠杆菌和拟南芥中的表达及免疫学研究

发布时间：2018-05-01 14:24

  本文选题：脑膜炎奈瑟氏菌 + fHbp　； 参考：《吉林大学》2016年博士论文

【摘要】：脑膜炎是由脑膜炎奈瑟氏菌引发的世界性传染病,具有高致死率、高传染性等特点,尤其对6个月至2周岁的婴儿具有极大易感性,即使痊愈也会留下永久性的神经后遗症。目前防治脑膜炎最有效的方法仍是接种疫苗。针对5种主要的致病血清型,已开发并批准了4种荚膜多糖结合疫苗的使用,即A、C、W和Y等四种。但血清型B的脑膜炎球菌因其多糖结构与人体组织的唾液酸同源,无法引起免疫反应,故缺乏有效的多糖疫苗。以fHbp为主要候选抗原的出现,为预防和控制B型脑膜炎(Men B)疫苗的开发和利用提供了一条有效的途径。本研究利用基因工程手段,从温州医科大学第一附属医院的一例B型脑膜炎患者中分离了一株Men B毒株中克隆fHbp基因,经生物信息学分析后构建原核表达载体p ET-22b-fHbp。热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得工程菌。确定当诱导温度为37℃,诱导剂IPTG的浓度为500m M,诱导时间为8hr的条件下,外源蛋白fHbp表达量达到最大值,约为总可溶性蛋白的20%,且为可溶性蛋白形式。经Ni2+Sepharose Fast Flow亲和层析纯化后获得了大肠杆菌表达的fHbp纯品,命名为E-fHbp。针对拟南芥密码子偏好性,对fHbp基因序列进行优化设计和化学合成。构建以菜豆Pha P启动子驱动密码子优化后的fHbp基因的植物表达载体p Pha P3301-rfHbp。利用农杆菌介导的沾花侵染法转化拟南芥,经浓度为1%的除草剂Basta筛选后共计获得300余株抗性植株,金标免疫试纸条(PAT/bar试纸条)检测结果288株阳性植株。进一步对抗性植株中的rfHbp基因进行PCR鉴定,共计获得87株阳性植株。对全部87株T1代转基因拟南芥种荚中的目的蛋白进行ELISA检测,筛选出5株fHbp表达量在0.1%以上的转基因株系。Southern检测表明,r HF-10、r HF-22和r HF-54三个植株为单拷贝插入,而Western和ELISA检测表明,r HF-22中目的蛋白的表达量最高为种子总可溶蛋白的0.349±0.072%。经Ni2+Sepharose Fast Flow亲和层析纯化,获得了植物源fHbp蛋白纯品,命名为A-fHbp。将上述实验中获得的不同来源的fHbp蛋白进行免疫实验,通过腹腔注射接种E-fHbp和A-fHbp,比较了两种不同来源的候选疫苗的免疫原性差异,结果表明E-fHbp与A-fHbp诱导血清特异抗体滴度分别达到4.2×104和4.8×104,且能够诱导乳兔补体产生SBA活性。对两种不同来源的fHbp蛋白进行小鼠Bal B/c的口服免疫实验,结果表明两者均未诱导免疫系统产生出粘膜Ig A。小鼠攻毒试验结果表明,E-fHbp对小鼠的保护率为76.67%,A-fHbp的保护率为80%,两者在作为候选疫苗的保护效果无显著差异。本研究首次完成fHbp蛋白在转基因植物种子中的表达与分离纯化工作,并比较了两种不同来源的fHbp蛋白在免疫学方面的差异,结果表明两者无显著差异,均具备候选疫苗的潜力。本研究为植物生物反应器生产蛋白亚基疫苗提供借鉴,尤其是为B亚型脑膜炎奈瑟氏菌候选疫苗的研究和开发提供了重要理论依据。
[Abstract]:Meningitis is a worldwide infectious disease caused by Neisseria meningitidis. It has the characteristics of high mortality and high infectivity. It is especially susceptible to infants aged 6 months to 2 years old. Vaccination is still the most effective way to prevent and treat meningitis. For five major pathogenic serotypes, four kinds of capsular polysaccharide conjugate vaccines were developed and approved. However, meningococcus serotype B has no immune response because its polysaccharide structure is homologous to sialic acid in human tissues, so it lacks an effective polysaccharide vaccine. The emergence of fHbp as the main candidate antigen provides an effective way to prevent and control the development and utilization of Meningitis B vaccine. In this study, fHbp gene was cloned from a Men B strain from a patient with type B meningitis in the first affiliated Hospital of Wenzhou Medical University by genetic engineering. The prokaryotic expression vector pET-22b-fHbpwas constructed by bioinformatics analysis. E. coli BL21 DDE3) was transformed by heat shock method to obtain engineering bacteria. When the induction temperature was 37 鈩，

本文编号：1829759