基于微卫星标记对我国部分地区裂头蚴种群的遗传多样性研究

发布时间：2018-05-01 21:01

  本文选题：曼氏迭宫绦虫 + 裂头蚴　； 参考：《郑州大学》2017年硕士论文

【摘要】：迭宫属绦虫的中绦期幼虫——裂头蚴,可寄生于人体引起裂头蚴病,主要表现为幼虫移行症,累及全身,可导致失明、肢体麻痹、甚至死亡。裂头蚴病呈世界性分布,但多见于东亚及东南亚国家。我国大部分地区均有人体裂头蚴病报道,累计超过1 000例,病例数为世界之最。近年来,裂头蚴病的发病趋势在部分地区呈上升态势,已被列为新现的动物源性寄生虫病。对我国的裂头蚴种群进行遗传结构和系统发生生物地理学研究,不仅对于了解我国迭宫绦虫种群的历史演化过程有基础性理论意义,而且对揭示它们如何响应气候变化和环境变迁,从而对制定裂头蚴病有效的防制策略具有指导意义。然而,目前关于我国裂头蚴的种群遗传多样性其分化模式等方面的研究还较薄弱。本研究利用公共数据库中现有的欧猥迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)成虫及裂头蚴的ESTs开发了4个多态性微卫星分子标记,并利用这4个位点对我国西南11个地区的裂头蚴类群进行了种群遗传多态性研究。材料与方法1.裂头蚴标本采集及鉴定:2014年5月至2015年9月,对我国四川、重庆和云南11个地区野生蛙体内裂头蚴的自然感染情况进行调查,并对阳性蛙体的裂头蚴进行收集,用无水乙醇密闭保存。利用通用型柱式基因组DNA提取试剂盒提取每一株标本的基因组DNA,基于cox1分子标记对采集的地理株进行分子生物学鉴定。2.微卫星分子标记开发:首先利用NCBI_BLAST和UniVec数据库掩蔽获取自公共数据库裂头蚴相关ESTs中冗余序列,然后使用CD_HIT_EST在线工具对ESTs聚类,最后利用MISA遵照单核酸重复10次及以上、2核苷酸和3核苷酸4次及以上、4核苷酸及5核苷酸和6核苷酸3次及以上、长度在100bp内的标准查找微卫星位点。选择以3核苷酸和(或)4核苷酸模式为主且位点侧翼序列符合引物设计要求的微卫星作为目的序列。利用Primer3设计目的序列引物,通过小样本预实验利用温度梯度PCR、琼脂糖凝胶电泳和PCR产物测序来检测扩增序列与原位点序列的一致性和多态性。3.目的序列扩增和测序:对确定与原位点序列一致且具有多态性的引物利用预实验确定的PCR条件和体系对所有地理株进行有效扩增,扩增产物一部分进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳加硝酸银染色(即PAGE银染),另一部分进行微卫星序列测序。4.PAGE及微卫星序列数据处理:对于银染数据,使用GenePop在线模块估算HO(观测杂合度)、HE(期望杂合度)、H(基因多样性)、哈德温伯格平衡和连锁不平衡检验、群体内近交系数Fis、固定系数Fst和总体近交系数Fit;使用Arlequin 3.5计算遗传分化指数FST和G-W指数(Garza-Williamson index);使用GenALEx 6.5进行分子变异分析(AMOVA)和主坐标分析(PCoA)。对于测序数据,使用MEGA v.6.06进行序列比对并对比对结果进行人工校正;使用DnaSP v.5.10进行单倍型(Haplotype)分析并分别构建不同微卫星标记的单倍型矩阵及多标记联合矩阵。5.遗传多态性分析:使用DnaSP v.5.10计算各地理群的单倍型多态性及核苷酸多态性;使用Network v.4.5对各个微卫星标记及联合序列进行单倍型网络的重建;分别使用最大简约、最大似然及贝叶斯推断法进行系统发育分析。最大简约分析在MEGA v.6.06中进行,树的搜索策略采用启发式搜索,分支交换法采用树二等分再连接的分支交换法,系统树每一分枝的置信度采用自引导法重复检验,设置2000次重复;使用PhyML软件进行最大似然分析,基因进化模型用赤池信息量准则在jModelTest 2中选择模型,分枝的置信度采用自引导法重复检验,设置2000次重复;采用MrBayes v3.1进行贝叶斯分析,运行1×108代,每100代对系统树进行抽样,使用收敛诊断法对稳定性进行重新评估,当分离频率的平均标准差小于0.02时则认为两次运行之间存在收敛。所有系统发育分析均运算两次。使用Arlequin3.5中岐点分布分析来评估裂头蚴种群的动态变化,并基于中性选择理论,对不同种群进行Fu’s FS检测和Tajima’s D检测。结果1.中国西南地区野生蛙类裂头蚴自然感染率:自中国西南11个不同地区(四川南充、营山、广安、乐山、自贡、泸州、达州、凉山州和云南昆明、保山及重庆梁平)共采集野生蛙类347只,经鉴定均为黑斑蛙(Rana nigromaculata)。其中64只感染裂头蚴,平均感染率为18.44%。不同地区裂头蚴感染率从6.67%到36.36%不等,最多的1只感染31裂头蚴,最少的感染1条。四川地区蛙类裂头蚴感染率较高,其中又以南充的感染率最高,达36.36%。2.微卫星位点筛选和引物设计:共获得12 481条裂头蚴相关ESTs,找到符合要求的微卫星915条,平均约1 779个碱基中含有1条微卫星位点。重复单元以单核苷酸为最多,占46.67%,其中重复大于15次的长序列以A/T模式为主,小于15次的短序列以C/G为主;其次是2核苷酸,占31.26%,又以AC/GT和AG/CT丰度最高;再次是3核苷酸分别为16.72%,数量最多的是AGG/CCT模式;最后是占4.48%的4核苷酸模式以及合计不足1%的5核苷酸和6核苷酸。通过小样本预实验从15个位点中筛选出了5个(C07、M15、I03、N11和M20)与预期位点序列一致的微卫星分子标记,经测序验证其中4个(C07、M15、N11和M20)具有多态性。3.基于PAGE银染数据的遗传多态性分析:5个微卫星标记和64株裂头蚴地理株共鉴定出13个等位基因,每个微卫星标记所鉴定出的等位基因数量为2~3个(平均2.60)。95%的地理株等位基因数不超过3个,平均每个地理株每个微卫星位点的等位基因数为1.89。I03位点上的杂合数量最少,只有18.75%,其次是N11位点,占26.56%。四川广安和南充地区具有最多的等位基因数(11个),平均等位基因数也最高(2.20),而四川达州和云南昆明的平均等位基因数最少(1.40),四川乐山在5个位点上均表现出多态性。所有地理株整体上总杂合度范围为0~0.682(平均值为0.322),每个地理种群观测杂合度(HO)的均值为0.436(范围为0~1.000)。哈德温伯格平衡检验结果表明本研究的所有地理株是一个整体种群中的随机个体(P0.05),且所选的微卫星位点之间不存在连锁不平衡(P0.05)。估算的Fis和Fit结果均为负值,表明群体观测杂合度大于期望杂合度,群体内存在杂交情况。在N11位点上群体间遗传分化较弱(Fst0.05),I03位点上群体间遗传分化较强(Fst0.25),C07、M20和M15为中等(0.05Fst0.15),所有位点上群体间遗传分化处于中等水平(0.05Fst0.15)。而各地理群G-W指数平均值均大于临界值0.68,表明整体上种群比较稳定,不存在种群扩张事件。AMOVA结果显示变异主要来样本个体之间,占总体的93%,在地理群之间的变异较小,只占7%。利用遗传距离和地理距离进行的PCoA分析显示云南保山、昆明地理群与四川各地理群及重庆梁平间差距明显,总体上可分为云南与四川+重庆两个大的群体。在地理株的水平上,云南昆明、保山和四川达州间存在部分重叠,但不与其它地理群重叠,除达州外的四川各地理群之间和重庆梁平间均有重叠存在。4.基于序列的遗传多态性分析:通过序列比对发现I03的多态性来自微卫星位点的侧翼序列上,因此在基于微卫星序列数据进行遗传多态性分析时剔除了I03位点。在剩余的4个位点中,基于C07标记共鉴定出4个单倍型,其中Hap1涵盖17个地理株,Hap2涵盖41个地理株,Hap3涵盖5个地理株,Hap4只包含1个地理株;M15标记共鉴定出9个单倍型,其中Hap1涵盖46个地理株,Hap4涵盖9个地理株,Hap6和Hap8分别包含2个地理株,Hap2、Hap3、Hap5、Hap7和Hap9均只有1个地理株;M20标记共鉴定出7个单倍型,其中Hap1涵盖10个地理株,Hap2和Hap7均涵盖2个地理株,Hap3包含30个地理株,Hap4涵盖13个地理株,Hap5涵盖6个地理株,Hap6只包含1个地理株;N11标记共鉴定出10个单倍型,其中Hap1涵盖21个地理株,Hap2包含18个地理株,Hap3包含6个地理株,Hap4涵盖9个地理株,Hap9涵盖3个地理株,Hap8和Hap10均涵盖2个地理株,Hap5、Hap6和Hap7均只有1个地理株;C07、M15、M20和N11总的单倍型多态性(Hd)及核苷酸多态性(Pi)分别为:0.175±0.061、0.00090±0.00032,0.468±0.072、0.01559±0.01007,0.553±0.057、0.00430±0.00062,0.581±0.064、0.00494±0.00077。分子差异度分析的结果显示种群之间的遗传差异度比种群内的要高。分别使用最大简约法、最大似然法和贝叶斯推断法对不同微卫星标记进行的系统发育分析结果表明,所有微卫星标记的单倍型均分为两个主要分枝,其中,C07标记的Hap4单独形成一个分枝;M15标记的Hap4和Hap5形成一个分枝;M20标记的Hap2和Hap5形成一个分枝;N11标记的Hap3、Hap4、Hap6和Hap7共同形成一个类群。基于单倍型的中接邻接网络分析的结果也显示西南地区裂头蚴的存在两个单倍型子网络,并且与系统进化树上的分枝相对应。其中,C07标记的Hap2是最主要的单倍型,频数为41;M15标记的Hap1是最主要的单倍型,频数为46;M20标记的Hap3是最主要的单倍型,频数为30;N11标记的Hap1和Hap2是最主要的单倍型,频数分别为21和18。结论1.我国西南地区野生黑斑蛙体内均存在裂头蚴自然感染情况,平均感染率为18.44%;2.基于欧猥迭宫绦虫成虫和裂头蚴的EST序列数据库,利用生物信息工具成功筛选出4组微卫星标记:C07、M15、M20和N11;3.PCoA分析结果表明我国西南地区裂头蚴存在2个种群,且地理隔离对裂头蚴的种群遗传多态性影响较大;4.基于不同微卫星标记的单倍型分析结果表明,我国西南地区裂头蚴种群的基因多态性水平较低;5.系统发育及单倍型网络分析结果均提示西南地区裂头蚴种群存在2种基因型,且这2种基因型在不同地理区域混合存在。
[Abstract]:In recent years , the research on the genetic structure and systematic biogeography of the population genetic diversity in China ' s Sichuan , Chongqing and Yunnan has been reported . Genetic polymorphism analysis was carried out by using DnaSP v.5 . 10 . The results showed that the number of alleles per microsatellite marker was only 18.75 % , and the number of alleles per microsatellite locus was at least 1 % . The number of alleles per microsatellite marker was 1 . 89 . Based on the genetic polymorphism analysis , there were only one geographic strain in the population , including two geographical strains , Hap2 , Hap3 , Happi5 , Happi7 and Hapten . The results of phylogenetic analysis showed that there were two main branches of C07 - labeled Hap3 , 0 . 01559 卤 0 . 00032 , 0 . 468 卤 0.072 , 0 . 01559 卤 0 . 01007 , 0 . 553 卤 0 . 057 , 0 . 00430 卤 0 . 00062 , 0 . 581 卤 0 . 064 , 0 . 00494 卤 0 . 00077 .

【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R383.35
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本文编号：1831033