功能化金纳米材料促进树突状细胞归巢并增强免疫应答作用

发布时间：2018-06-14 18:35

本文选题：树突状细胞疫苗 + 纳米金　；参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年博士论文

【摘要】：背景:树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁,并且是唯一可以激活幼稚T细胞(Na?ve T Cells)的一类抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APCs)。骨髓或外周血单个核细胞在体外经粒细胞-巨噬细胞(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)的联合刺激下可诱导分化为DCs,这一发现开启了过继性DCs免疫治疗的大门。然而,在接受DCs治疗的肿瘤或慢性感染性患者中,仅有10 15%的临床响应率。近二十年的研究表明,较低的抗原负载效率和体内归巢能力(5%)是DCs治疗失败的主要原因。因此,如何最大程度提高DCs体外抗原负载效率和体内归巢能力是提高DCs疫苗效果的关键,而该问题解决依赖于新的技术和方法以优化传统DCs生产和制备工艺,并加强对DCs体内生物学行为的了解和把控。近年来,纳米科技方兴未艾,各种新型功能化纳米材料层出不穷,在多个研究领域显示出了令人瞩目的潜在应用价值,生物医药领域也是其中之一。有研究表明,直接注射携带有抗原和免疫佐剂的纳米材料可显著提高免疫应答作用,然而目前仍有一些问题尚缺乏深入了解,比如,如何通过优化纳米材料的理化性质以调控过继性DCs的生物学效应?纳米材料负载的DCs在体迁移、归巢模式及作用机制是什么?纳米材料可否通过促进DCs抗原递呈和调控DCs的分布以强化DCs疫苗效果?全面认识纳米材料与DCs的相互作用规律及其机制对于开发新型DCs纳米佐剂以加强肿瘤或感染性疾病的治疗具有重要意义。目的:针对过继性DCs疫苗和纳米疫苗悬而未决的问题,本研究旨在对功能化金纳米载体的理化性质进行优化,以最大程度提高过继性DCs疫苗的抗原递呈效率和成熟程度,对纳米佐剂刺激下DCs的在体内迁移和归巢模式进行探讨,揭示其作用机制,并最终观察纳米材料所激活在体T细胞免疫应答和抗感染疫苗效果。方法及结果:(1)金纳米粒子的制备:采用化学还原法及种子媒介法制备出10 90 nm范围的球形、棒状及立方体金纳米粒子(Gold Nanoparticles,AuNPs),并用透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)和表面等离子体共振吸收光谱(Surface Plasmon Resonance,SPR)对所制备纳米离子粒径、形貌和光学性质进行表征。tem结果显示所制备纳米粒子形态均匀,粒径分布在预期范围内,球型纳米金粒径分别约为15nm(aunp15)、30nm(aunp30)、40nm(aunp40)、60nm(aunp60)和80nm(aunp80);棒状纳米金大小约为53nm×25nm(aunr,长径比2.1);立方体纳米金大小为45nm×45nm×45nm(aunc)。spr结果显示该几种纳米粒子等离子共振吸收峰分布在400 900nm范围内。(2)金纳米粒子的功能化修饰:以ova257-264(ovap)和toll样受体9(toll-likereceptor9,tlr9)配基cpg-odns分别作为dcs疫苗的模式抗原肽和免疫刺激剂对所制备7种粒径aunps进行功能化修饰。以残留荧光值对ovap和cpg-odns的上量和偶联效率进行评估,结果表明90%以上的ovap和cpg-odns可成功以au-s键的形式偶联于aunps表面;继而,采用激光粒度仪对修饰后的7种aunps分别在水溶液和1640完全培养基两种溶剂中行流体力学半径和zeta电位测量,结果发现,与单纯aunps相比,表面修饰ovap的aunps(aunp/ovap)在水溶液中电性质发生反转,与带有正电荷的ovap电性质相同;经cpg-odns修饰aunps(aunp/cpg-odns)带有负荷,与cpg-odns电性质相同;然而,当修饰后的纳米粒子分散于1640培养基中时,由于大量的带负电荷的血清蛋白的存在,上述两种功能化纳米粒子均带负电荷。(3)金纳米载体的粒径筛选:将ovap修饰的7种纳米粒子分别与dcs在体外共孵育,用流式细胞术检测dcs表面mhci与ovap的复合体,以筛选dcs交叉抗原递呈效率最高的aunps粒径和形貌。结果显示,与游离抗原肽相比,所有aunps/ovap均可显著提高dcs抗原递呈效率,其中以aunp60最优。同样,通过检测dcs表面共刺激分子和孵育上清中th1类促炎因子(il-12p70、il-1β、il-6和tnf-α)的表达,发现aunp80/cpg-odns为最优cpg-odns纳米载体,且其刺激效果与aunp80/cpg-odns的孵育剂量呈正相关关系。(4)金纳米载体的组合模式及孵育剂量筛选:基于筛选得到载体(aunp60和aunp80),继续比较两种纳米载体设计模式下dcs抗原递呈和细胞成熟情况,结果发现,纳米金鸡尾酒组合模式即nanoau-cocktail(aunp60/ovapaunp80/cpg-odns)优于双功能模式(aunp60/ovap/cpg-odns或aunp80/ovap/cpg-odns),可使dcs同时达到高效的抗原递呈和细胞成熟度。进一步对nanoau-cocktail与dcs共孵育的剂量进行筛选和优化发现,尽管nanoau-cocktail的孵育剂量在12.5-50μg/ml范围内对dcs细胞活性无明显影响,但中等的nanoau-cocktail孵育剂量(25μg/mlaunp60/ovap和25μg/mlaunp80/cpg-odns)为dcs孵育的最佳剂量。在该剂量下,与“游离ovap/cpg-odns”相比,dcs抗原递呈效率可提高4-5倍,各th1类炎症因子亦有4-20倍的提高。tem结果显示,被吞噬的aunp60/ovap和aunp80/cpg-odns均定位于dcs溶酶体中。(5)nanoau-cocktail负载的dcs疫苗在体归巢及分布研究:采用高灵敏生物发光成像法(bioluminescenceimaging,bli)对nanoau-cocktail负载的dcs在体迁移和分布模式进行探讨。结果显示,经nanoau-cocktail负载后,dcs向淋巴组织归巢能力明显提高,在48h时主要聚集在淋巴组织或脏器中;而“游离cpg-odns/ovap”负载的dcs仍有大量滞留在肺脏、肝脏等非淋巴器官。为进一步排除bli在深部组织器官成像灵敏度低的影响,分离小鼠各淋巴脏器和组织器官,体外分析dcs归巢数量,结果发现,肝脏引流淋巴结(liverdraininglymphnods,llns)是“nanoau-cocktail负载的dcs”聚集最多的淋巴结,占全部淋巴组织归巢dcs的60%。免疫荧光的结果进一步确定了该结果,并发现归巢dcs主要定位于淋巴器官的t细胞区。(6)nanoau-cocktail促进dcs淋巴组织归巢及机制研究:采用流式细胞术来检测“nanoau-cocktail负载的dcs”及“游离ovap/cpg-odns负载的dcs”表面趋化因子受体ccr1、ccr2、cxcr4、ccr5及ccr7的表达率,结果发现前者表面ccr7表达显著高于后者,而ccr1、ccr2及cxcr4分子的表达低于后者。采用腺病毒转染ccr7-shrna的方法下调dcs表面ccr7的表达,进一步研究ccr7的表达与dcs淋巴组织归巢的相关性。结果发现,ccr7下调表达后,“nanoau-cocktail负载的dcs”的淋巴结归巢能力大大降低,反向证明了nanoau-cocktail所引起的dcs表面ccr7的上调表达是促使其向淋巴结归巢的主要原因。除此之外,本研究同时采用免疫荧光的方法对dcs的细胞骨架进行分析,发现相较于“游离ovap/cpg-odns负载的dcs”,“nanoau-cocktail负载的dcs”的细胞骨架发生了更有利于其趋化和迁移的重排。(7)nanoau-cocktail促进dcs疫苗激活在体t细胞研究:为检测dcs激活t细胞能力,首先采用带荧光标记四聚体(tetramer)以特异性识别ovap特异性cd8+t细胞;结果显示,经“nanoau-cocktail负载的dcs”免疫的小鼠,在llns和脾脏(spleen,spl)两种淋巴器官中均可高比例检测到抗原特异性cd8+t细胞激活,其比例显著高于“游离ovap/cpg-odns负载的dcs”免疫组,且llns中cd8+t细胞的激活比例高于spl(5.77±1.94%vs.1.45±0.12%)。随后,将分离自llns和spl中淋巴细胞与ovap体外共孵育4h后,流式检测cd8+t细胞中ifn-γ的合成,该结果与四聚体检测结果一致,进一步证明了“nanoau-cocktail负载的dcs”在激活抗原特异性t细胞方面远优于“游离ovap/cpg-odns负载的dcs”。(8)NanoAu-Cocktail促进DCs疫苗抗病毒作用研究:构建同时表达萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)、绿色荧光蛋白(GFP)和OVAp的5型嗜肝腺病毒载体(AdFLGO)以模拟肝脏病毒感染。小鼠接受DCs免疫5天后,以109 pfu/鼠经尾静脉接种ADFLGO,采用BLI和免疫荧光两种方法检测病毒清除情况。结果显示,在“NanoAu-Cocktail负载的DCs”免疫小鼠中,病毒在感染3天后基本得到完全清除,而“游离OVAp/CpG-ODNs”组仍可检测到大量病毒存在,说明“NanoAu-Cocktail负载的DCs”在抗感染疗效上优于“游离OVAp/CpG-ODNs负载的DCs”。结论:通过体内外实验分析发现,由AuNP60/OVAp和AuNP80/Cp G-ODNs组成的NanoAu-Cocktail可使DCs疫苗的抗原递呈能力提升4-5倍,其总淋巴组织归巢数量和LLNs归巢数量分别提高15倍和36倍。进一步研究发现,经NanoAu-Cocktail负载的DCs可在SPL和LLNs中有效激活抗原特异性CD8+T细胞反应,相较于“游离CpG-ODNs/OVAp”负载DCs分别高6.5倍和3.4倍。最后,基于NanoAu-Cocktail的过继性DCs疫苗可有效保护小鼠免于肝脏病毒的感染,且该疫苗效果优于经典的Cytokine-Cocktail负载的DCs疫苗和和传统的可直接用于皮下免疫的蛋白疫苗。本研究从AuNPs形貌和粒径的选择出发,并对AuNPs的修饰模式和剂量配比的优化筛选,最终揭示了纳米佐剂负载的DCs在体迁移、归巢、分布模式及其机制,以期为新型DCs疫苗的开发和临床转化提供参考。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392;TB383.1

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