霍乱弧菌进入活的非可培养状态的影响因素及调控机制

发布时间：2018-06-23 03:08

本文选题：霍乱弧菌 + 活的非可培养状态　；参考：《中国疾病预防控制中心》2016年博士论文

【摘要】：为了在不利的环境中保持存活的能力,霍乱弧菌会进入一种活的非可培养(VBNC)状态。VBNC这一现象已经被认识30年了,但对研究者来说依然是待解开的谜团。为了更好的认识这一现象,我们以霍乱弧菌为模式菌,设计并实施了以下三个方面的研究来解释这一现象。在第一个部分的研究中,我们利用propidium monoazide(PMA)结合荧光定量PCR对VBNC状态的霍乱弧菌01群埃尔托性菌株C6706进行定量分析。首先对108/mL的鲜活细胞、死亡细胞和VBNC细胞对不同的PMA处理程序进行时间-剂量-反应关系分析。结果显示最优的PMA处理方案为20μM孵育20分钟,因为这可以最大限度的去除死亡细胞,但对鲜活细胞和VBNC细胞几乎没有影响。然后,我们评价了该方案在处理不同浓度细菌时的稳定性和检出下限,发现初始细菌的浓度对PMA处理的效果有很大影响。我们开发了一种利用108/mL的外源死细胞悬液来对抗初始细胞浓度副作用的方法。利用这个方案,消除了初始细胞浓度过低的影响,得到了稳定的计数结果,并将该方法对VBNC细胞计数的检出下限提升至10拷贝/μL。在第二部分的研究中,我们逐一评价了实验室常规使用的VBNC诱导条件的5个组成因素对VBNC诱导的影响,即菌株差异、生长期差异、通氧差异、不同的温度以及饥饿。其中菌株差异、生长期差异和通氧差异不影响VBNC状态的形成,但是影响其发展过程。霍乱弧菌O1群古典型的菌株比埃尔托型菌株进入VBNC的速度要快。以平台期细胞为初始细胞完全进入VBNC的时间(LCT100)要晚于对数期细胞。但是在诱导前期,对数期细胞可培养菌数下降的速度却比平台期要慢,这提示平台期细胞状态的不均一性可能在起作用。在诱导过程中,通氧可以快速使霍乱弧菌丧失可培养的能力,厌氧环境下的可培养细菌数可达到通氧条件的106倍。其余的两个因素(较高的温度和富营养)却可以阻止霍乱弧菌VBNC状态的发生。在22℃和37℃诱导时,霍乱弧菌快速丧失可培养能力,在可培养细菌数分别达到106/mL和105/mL时维持恒定。活菌数和总菌数的结果表明在这两个温度下,丧失可培养能力的霍乱弧菌没有进入VBNC状态,而是不断死亡和降解。当在ASW中加入LB时,VBNC的诱导也被阻止,但加入低营养的M9不影响。这表明LB和M9不同的成分可能会抑制VBNC的诱导。在第三部分的研究中,我们发现群体感应系统(QS)可以对抗霍乱弧菌VBNC状态的诱导。利用转座子突变技术,我们筛选到了一株在4℃ASW中可培养能力被延长的突变株,并发现该菌株的转座子插入位点为rpoN基因。进一步研究发现受rpoN基因调节的hapR基因被失活后,菌株进入VBNC状态的进程明显加快。而高表达HapR可以延缓霍乱弧菌可培养能力的丧失。缺失qrrs,lux0和rpoN均可使可培养细菌存在的时间相比hapR缺失株延长50天以上。然后我们发现野生株也利用上调表达hapR来对抗其在VBNC诱导过程中可培养能力的丧失。在野生株诱导过程中hapR的转录上调,使其可培养细菌存在的时间比hapR缺失株延长10天。当hapR缺失株回补hapR基因后,其hapR的转录和表达水平,以及可培养能力的变化群恢复到野生株水平。在天然QS突变株中,高表达HapR表现为对VBNC诱导过程中可培养能力丧失的抵抗;低表达或无表达HapR则表现为可培养能力丧失的加速。这些菌株的存在表明了生态环境的压力对霍乱弧菌QS进化的影响。这些研究将有助于将来对VBNC状态如何发生发展机制的研究。同时也帮助深入认识在VBNC诱导过程中霍乱弧菌进行了哪些生命活动,以及环境压力对不同VBNC发展能力的菌群的筛选。
[Abstract]:In the study of the first part , we evaluated the stability and the lower limit of VBNC . In the study of the second part , we evaluated the stability and the lower limit of the initial cell concentration .
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.3

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