Nrf2蛋白精氨酸甲基化修饰及其在抗氧化过程中的作用和机制研究

发布时间：2018-07-20 21:37

【摘要】：由于机体经常暴露于来自内源或外源的氧化物和亲电物质之下(如线粒体的有氧呼吸、紫外线、化学试剂等),导致机体内产生大量的活性氧自由基(ROS)。一旦ROS在细胞内积累过多,将导致氧化作用超出氧化物的清除,引起氧化还原反应失衡,即氧化应激。在细胞水平上,氧化应激能引起细胞氧化损伤,从而导致细胞死亡或凋亡。在生理水平上,氧化应激可导致慢性、急性炎症,并可能引起癌症、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等疾病的发生。通常机体内存在一套成熟的抗氧化防御机制来中和细胞产生的过量ROS,从而保护细胞和组织免受氧化损伤。在细胞抗氧化过程中,转录因子Nrf2作为最核心的调控分子参与到保护细胞免受氧化应激损伤的调控过程中。其中Keap1-Nrf2-ARE信号通路被认为是抗氧化机制中最重要的信号通路。细胞在正常生理水平下,Nrf2在细胞质中与Keap1蛋白结合,后者介导Nrf2被泛素化降解,使Nrf2维持在一个较低的表达水平;当细胞发生氧化应激时,氧化物与Keap1结合,阻碍了 Nrf2-Keap1复合物的形成,从复合物中脱离出的Nrf2可被PKC激酶磷酸化,促进其进入细胞核中,结合到其靶基因(Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因)启动子的ARE序列元件上,激活靶基因的表达,从而达到抗氧化的目的。近些年来,越来越多的实验证据表明,Nrf2蛋白的活性受到多种翻译后修饰的调控,如泛素化、磷酸化、乙酰化和SUMO化等。Nrf2蛋白的翻译后修饰与Nrf2功能蛋白的活性、结构和功能密切相关,在该领域的研究有利于揭示Nrf2在细胞抗氧化过程新的作用机制。已有的研究发现,Nrf2蛋白的多个赖氨酸位点能够被p300/CBP乙酰化,增强其转录活性,并且有研究表明,在p300/CBP复合物中包含两种精氨酸甲基转移酶,PRMT1和CARM1,作为转录辅激活因子参与转录调控。但是目前并没有关于Nrf2蛋白精氨酸甲基化修饰及其功能的报道。我们通过体外甲基化实验,发现Nrf2蛋白在体外能够被PRMT1甲基化,但是不能被CARM1甲基化。同时,内源IP实验和外源GST-pull down实验证实,细胞中的Nrf2也能被PRMT1甲基化,并且两者是相互结合的。我们对甲基化的Nrf2蛋白进行质谱分析,发现Nrf2的第437位精氨酸被PRMT1甲基化;同时将Nrf2第437位精氨酸突变成赖氨酸后的体外甲基化实验结果表明,Nrf2蛋白第437位精氨酸确实是唯一被PRMT1甲基化的位点。通过对Nrf2蛋白的结构域分析发现,此位点位于Nrf2的DNA binding结构域中。因此,我们推测,Nrf2蛋白第437位精氨酸甲基化修饰很可能与其DNA binding功能相关。正如我们预期的那样,通过Realtime PCR分析,我们发现甲基化的Nrf2能够促进其靶基因HO-1、GCLM和TXNRD1的表达;进一步的ChIP以及EMSA等实验表明,无论干涉PRMT1还是过表达第437位精氨酸突变成赖氨酸的Nrf2,都降低了Nrf2结合到其靶基因启动子上的能力。为了进一步探究甲基化的Nrf2的生理功能,我们利用氧化剂叔丁基过氧化氢处理细胞产生氧化压力,建立了细胞的抗氧化模型。在此模型下,我们发现,Nrf2的甲基化水平在细胞的抗氧化过程中呈上升趋势,这表明Nrf2的甲基化在抗氧化过程中发挥重要作用。而进一步通过细胞活力检测实验和细胞总谷胱甘肽水平检测实验,我们发现在细胞的氧化应激过程中,甲基化的Nrf2能够促进细胞的抗氧化能力,从而提高细胞的存活力,保护细胞免受氧化应激的损伤。综上,我们的研究发现了 Nrf2蛋白新的翻译后修饰类型,即精氨酸甲基化修饰。证实Nrf2蛋白第437位精氨酸被PRMT1甲基化修饰,这种修饰增强了 Nrf2蛋白在细胞抗氧化中的作用。并初步揭示了 Nrf2蛋白精氨酸甲基化修饰增强抗氧化作用的分子机制。该研究成果为开发靶向Nrf2翻译后修饰的精准医疗药物,从而预防氧化损伤引起的疾病提供了重要的理论基础。
[Abstract]:In recent years , the expression of Nrf2 - Keap1 protein can be induced by oxidative stress , which can lead to cell death or apoptosis . In the process of cell oxidation , the expression of Nrf2 protein can be induced by various post - translational modifications , such as ubiquitination , phosphorylation , acetylation and SUMO . In this paper , we found that the methylation of Nrf2 plays an important role in the anti - oxidation of Nrf2 .
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363

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本文编号：2134860