【摘要】：目的：为研究减味寿胎丸的安胎机理,用减味寿胎丸高剂量、中剂量、低剂量(以下简称高剂量组、中剂量组、低剂量组)、阳性对照药环孢素(CsA)四种药物干预自然流产(SA)病证结合模型小鼠,通过酶联免疫吸附技术(ELISA)检测血清白介素(IL-17)、苏木精-伊红染色法(HE)观察各组小鼠蜕膜、胚胎、卵巢的形态学变化,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应法(RT-qPCR)、免疫组化法(IHC)、蛋白印迹法(WB)检测各组孕小鼠蜕膜组织中IL-17、叉头/翼状螺旋转录因子3(Foxp3)、维甲酸孤核受体(ROR γt)、孕激素受体PR基因与蛋白的表达差异,进而找出减味寿胎丸在本模型中发挥安胎机制的作用靶点,并探讨减味寿胎丸与CsA是否能逆转SA病证结合模型小鼠存在的Th17细胞/调节性T细胞(Th17/Treg)平衡偏移。方法：1.观察各组孕小鼠实验过程中的一般情况、造模及药物干预前后的体重变化、胚胎吸收率,ELISA法检测各组孕小鼠血清IL-17含量的差异。2.RT-qPCR检测各组孕小鼠妊娠子宫蜕膜组织中IL-17 mRNA、Foxp3 mRNA、ROR γt mRNA、PR mRNA的表达差异；HE染色法观察各组孕小鼠蜕膜、胚胎及卵巢中卵泡与黄体的形态学差异,IHC与WB检测各组孕小鼠IL-17、Foxp3、PR、ROR γt蛋白表达的差异。结果：1.造模成功的标准：肾虚的评价：见小鼠畏寒喜暖、蜷缩拱背、体毛枯疏、失去光泽、精神萎顿、倦怠嗜睡,自主活动次数明显减少、行动困难,眯眼、呼吸短促,躁动、易惊；进食量和饮水量下降,大便稀溏(肛门会粘有稀溏臭秽的大便)、小便清长；尾巴发凉,体温下降、反应迟钝,体重增长减慢甚至下降,开口变小,消化道涩滞,灌胃困难,有食物反流于口中。部分小鼠出现妊娠期间阴道流血甚至胚胎的排出,符合小鼠肾虚的生理病理表现,提示造模成功。空白组及减味寿胎丸高、中、低剂量组和阳性对照组的小鼠一般状态良好,体毛顺滑有光泽,精神状态良好,活动自如,进食、进水量正常,体重增加,组间差异不大。2.妊娠第0天、第4.5天、第9天,各组孕小鼠体重无组间差异。妊娠第0天与妊娠第4.5天各组孕小鼠体重有组内差异；妊娠第4.5天与妊娠第9天各组孕小鼠体重有组内差异。3.各组小鼠胚胎吸收率：模型1组、模型2组与空白组相比较,差异具有统计学意义(P0.0016),高剂量组与模型1组相比较,差异无统计学意义(P0.0016)；中剂量组、低剂量组、阳性对照组与模型1组相比较,差异具有统计学意义(P0.0016)；中剂量组、低剂量组、阳性对照组组间两两比较,差异无统计学意义(P0.0016)。4.模型1组、模型2组与空白组的孕小鼠血清IL-17水平有显著差异(P0.01)；模型2组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性药组与模型1组的孕小鼠血清IL-17水平有显著差异(P0.01)；高剂量组与中剂量组、低剂量组、阳性对照组相比较,差异具有显著性(P0.01)；中剂量组与低剂量组相比较,差异具有统计学意义(P0.05)；中剂量与阳性对照组相比较,差异具有显著性(P0.01)；低剂量组与阳性对照组相比较,差异无统计学意义(P0.05)。5.RT-qPCR结果显示：小鼠蜕膜组织中Foxp3 mRNA、PR mRNA的表达,模型1组、模型2组较空白组明显下调,药物干预的四个组较模型1组的表达明显上调；IL-17mRNA、 ROR γt mRNA模型1组、模型2组较空白组明显上调,药物干预的四个组较模型1组的表达明显下调；以上药物四个组组间上述四个基因的表达未见明显趋势性差异。6.免疫组化结果显示：小鼠蜕膜组织中Foxp3、PR蛋白的表达,模型1组、模型2组较空白组明显下调,药物干预的四个组较模型1组的表达明显上调；IL-17、ROR γt蛋白模型1组、模型2组较空白组明显上调,药物干预的四个组较模型1组的表达明显下调。Foxp3、IL-17蛋白的表达,药物干预的四个组组间未见明显趋势性差异。中药3个剂量组对PR、ROR γt蛋白表达的调节效能均优于阳性对照组,但中药3个剂量组之间未见明显趋势性差异。7.蛋白印迹法结果显示：小鼠蜕膜组织中Foxp3、PR蛋白的表达,模型1组、模型2组较空白组明显下调,药物干预的四个组较模型1组的表达明显上调；IL-17、ROR γt蛋白的表达,模型1组、模型2组较空白组明显上调,药物干预的四个组较模型1组的表达明显下调。PR蛋白的表达,药物干预的四个组组间未见趋势性显著差异,表明中药3个剂量组与阳性对照组对该蛋白的调节效能相似。中药3个剂量组对Foxp3、 ROR γt蛋白表达的调节效能均优于阳性对照组,且中药3个剂量组对二者的调节效能呈趋势性差异,其从高到低排序为：中剂量组低剂量组高剂量组。中药3个剂量组对IL-17蛋白表达的调节效能均优于阳性对照组,且中药3个剂量组对二者的调节效能呈趋势性差异,其从高到低排序为：低剂量组中剂量组高剂量组。结论：1.本实验应用羟基脲建立SA小鼠CBA/J×DBA/2病证结合模型,初步得到该模型建立的标准化流程。模型组小鼠妊娠子宫蜕膜组织中存在Foxp3、PR基因与蛋白的低表达,而IL-17、ROR γt基因与蛋白的优势性表达。2.减味寿胎丸不同剂量组可以不同程度的上调Foxp3基因与蛋白的表达；下调IL-17、ROR γt基因与蛋白的表达；上调PR基因与蛋白的表达。3.根据小鼠胚胎吸收率推论：Foxp3、IL-17、PR、ROR γt基因与蛋白可能为减味寿胎丸与CsA在本病证结合SA小鼠模型中发挥安胎机制的作用靶点。本研究提示：IL-17为Th17高特异性分泌,ROR γt为Th17特异性转录分子,此二者的高表达代表Th17细胞因子的高表达及其优势性地位；Foxp3为Treg的特异性转录分子,Foxp3的高表达代表Treg细胞因子的高表达及其优势性地位,结合上述实验结果可知,在病证结合模型中,Th17细胞因子优势性表达；药物干预后这一优势性表达发生逆转,呈现Treg细胞因子的优势性表达,可见药物干预使病证结合模型组Th17细胞因子优势性表达转向Treg细胞因子的优势性表达,从而纠正了病证结合模型组存在的Th17/Treg平衡偏移。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R271.9;R-332
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本文编号：
2251486
