金黄色葡萄球菌激活中性粒细胞致血管渗漏机制研究

发布时间：2018-10-10 06:47

【摘要】：金黄色葡萄球菌是引起感染的常见的病原菌,特别是社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)的出现,严重的威胁到人类的健康。CA-MRSA的轻微感染会引起皮肤或软组织等定植感染,严重感染可引起比如脓毒症、中毒性休克综合征等。一些临床症状显示,在金葡菌引起的严重感染的前期伴随有水肿、低血压,血浆渗漏等现象,疾病后期则会演变为休克、多器官衰竭等症状,这些现象表明在金葡菌感染的过程中存在重要的病理学变化-血管内皮屏障的损伤。文献调研显示,目前已报道的金葡菌感染引起内皮屏障通透性改变的主要毒力因子有四种:超抗原类蛋白、α-溶血素、杀白细胞素和半胱氨酸蛋白酶类,通过直接或间接作用于血管内皮细胞影响血管通透性。除此之外,一些临床上的研究显示仍有一些未知的作用机制。在对脓毒症的临床研究中发现,中性粒细胞(PMN)来源的肝素结合蛋白(HBP)在细菌性脓毒症发生的过程中可以监控病程发展以及预后,而且与血管通透性的改变关系密切。在研究A族链球菌引起脓毒症的致病机制中发现,链球菌M蛋白可以与血浆中的纤维蛋白原结合,然后通过β2整合素受体激活PMN脱颗粒释放HBP,引起血管渗漏。同样本实验室的前期研究发现在猪链球菌感染引起的中毒性休克综合征中,病人血清中的HBP高于正常水平,经过研究发现猪溶素Sly是其重要的刺激因子,这些研究基础为我们寻找金葡菌毒力因子与血管内皮细胞之间的作用的新机制提供了重要线索。为了研究金葡菌感染与HBP的关系,我们首先收集了一些金葡菌严重感染、具有脓毒症、多器官衰竭等临床症状的病人血清以及一些健康人血清,另外还收集了多株临床分离的CA-MRSA和HA-MRSA菌株,进行刺激HBP释放的评价,确定了HBP浓度升高与金葡菌严重感染之间存在显著相关性。同时结果显示CAMRSA的刺激能力比HA-MRSA高,这些为我们进一步的研究金葡菌中HBP的刺激源奠定了基础。随后,为了确定上清中的刺激源,我们从性质入手,用蛋白酶K与热灭活处理确定了刺激源是耐热蛋白质,通过离子交换柱的分离纯化并结合体外活性检测以及高分辨率的SDS-PAGE分析发现高活性组分与低活性组分在约3KD处存在差异条带,然后用乙醇萃取方法将上清中小分子多肽抽离出,经过功能验证后进行质谱分析,我们共鉴定出了多种活性成分,其中包括3种PSMα(PSMα1,PSMα2,PSMα4)以及δ毒素。结合文献调研,α型PSM是金葡菌重要的毒力因子,被认为是引起CAMRSA高毒力的原因之一,虽然PSMα1-3对中性粒细胞的裂解能力可以达到80%-90%,但是研究发现血清中的高密度脂蛋白可以与PSMα结合导致其功能丧失。随后有研究报道PSMα能介导金葡菌在吞噬细胞内裂解细胞进行逃逸的新功能,这也意味着游离的PSMα1-3在生理条件下可能不能有效的发挥作用。为了进一步研究质谱鉴定出的活性成分与HBP的关系,我们合成了这五种多肽,用模拟人体内环境的全血体系以及离体PMN加血清的实验对它们进行HBP释放功能评价。结果发现与其它三种多肽相比,PSMα4可以摆脱血浆脂蛋白的封闭激活中性粒细胞释放HBP,进而又通过敲除株、互补株实验确定PSMα4是金葡菌上清中重要的HBP刺激源,并通过观察CD63分子的移动以及髓过氧化物酶(MPO)和弹性蛋白酶(Elastase)的释放确定了HBP的释放是通过PSMα4激活PMN脱颗粒实现的。在对受体和信号通路的研究中,我们发现甲酰基对PSMα4功能发挥有重要作用,而文献报道的PSMα引起的PMN趋化与钙离子内流不需要甲酰基的参与。说明这是FPR2受体介导的两种不同通路。抑制剂作用发现PI3K对HBP释放起重要作用,与细胞骨架重排相关的Rac2分子也可能参与其中。钙离子螯合剂EGTA以及胞内钙离子探针结果说明PSMα4引起HBP的释放与钙离子内流也有紧密的联系。考虑到PSMα4是PSMα四种甲酰化肽中唯一可以刺激HBP释放的,说明除了甲酰基外还有其它的氨基酸位点发挥作用,我们采用丙氨酸扫描突变法筛选关键位点,发现了一些位点突变会导致PSMα4刺激HBP释放的能力完全丧失;这些位点究竟如何影响PSMα4的功能有待于进一步的研究。接着我们通过构建单层细胞Transwell模型以及小鼠皮肤渗漏的Miles assay进行PSMα4功能评价。结果发现PSMα4与PMN作用后的上清会增加内皮细胞的通透性,加入HBP抗体后这种影响会被抑制。同时也检测到了与脱颗粒紧密相关的呼吸爆发,这些结果验证了HBP在PSMα4引起血管内皮细胞通透性改变中的重要作用。在小鼠皮肤渗漏实验中,野生株、敲除株和互补株上清以及合成多肽评价证明了PSMα4是引起小鼠皮肤血管渗漏的主要原因,通过抑制剂WRW4的实验结果说明PSMα4是通过FPR-2受体介导渗漏。为了进一步的验证PMN在这个过程中的重要作用,我们构建了中性粒细胞减少症(neutropenic)小鼠,野生株培养上清和PSMα4多肽在neutropenic小鼠皮肤造成的渗漏明显低于野生型小鼠。然后我们将分离得到小鼠PMN与PSMα4共孵育上清注射进入neutropenic小鼠皮肤内,与对照组多肽相比,实验组小鼠皮肤出现的渗漏更加严重。同时也检测到了可能与HBP同源类似物同储存于初级颗粒中的的小鼠髓过氧化物酶(MPO),这些结果进一步证实了在小鼠皮肤上引起血管渗漏的是来自于中性粒细胞的分泌物。最后我们用小鼠感染模型来评价PSMα4通过激活中性粒细胞脱颗粒引起血管渗漏。我们取血管渗漏现象较明显的肺部进行观察,通过肺部的组织切片HE染色与扫描电镜的观察结果可以看出,感染野生株的小鼠肺组织间隙中有明显的红细胞以及血浆的渗出,而敲除株以及PBS对照组没有这种现象。综上所述,通过研究我们发现金葡菌毒力因子PSMα4可以摆脱血清脂蛋白的封闭通过FPR-2受体激活中性粒细胞脱颗粒产生HBP,并在细胞和小鼠模型中观察到通透性改变与血管渗漏的现象。一方面从新的角度对PSMα4功能的独特性进行诠释,另一方面论证了PSMα尤其是PSMα4在金葡菌感染中的重要作用,对于完善补充金葡菌致病机制特别是对于脓毒症、中毒性休克综合征等重度感染的研究有很好的指导意义。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378.11

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