人源特异性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

发布时间：2018-11-16 18:49

【摘要】：【目的】构建人源特异性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌体抗体库,筛选人源抗3型、7型腺病毒中和活性抗体。【方法】从含有抗3型和7型腺病毒高中和效价(㧐1:1000)抗体的志愿者全血中分离外周血单个核细胞(PBMC),提取总RNA后经逆转录PCR(RT-PCR)制备c DNA,然后以cDNA为模板分别扩增抗体轻链、重链可变区序列,再以pComb3噬菌体质粒为模板分别扩增轻链恒定区(Cκ/λ)和重链恒定区(CH1),将轻链可变区和轻链恒定区进行重叠延伸PCR(SOE-PCR),重链可变区和重链恒定区进行SOE-PCR,分别形成κ/λ轻链和Fd重链,再以κ/λ轻链和Fd重链为模板进行SOE-PCR,最终形成完整的Fab基因,Fab基因连接至p Comb3噬菌体质粒中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13KO7进行超感染,构建人源特异性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌体抗体库。以纯化的3型、7型腺病毒完整病毒颗粒作为抗原进行亲和筛选,经过4轮筛选,富集特异性结合抗3型、7型腺病毒噬菌体抗体。化学发光酶免分析法(CLEIA)鉴定每一轮筛选后的总噬菌体以及第四轮筛选后的噬菌体单克隆,同时对获得的阳性克隆进行型别(Adv14、Adv55)特异性检测。获得的阳性单克隆进行DNA测序,然后将抗体序列IMGT/V-QUEST数据库中进行抗体序列分析,确定其CDR区和重轻链型别。从阳性克隆中提取质粒Pcomb3-Fab作为模板,分别扩增特异性轻链、重链可变区基因,并利用同源重组方法分别将轻、重链可变区基因克隆至真核表达载体Igk和IgH。共转染293T细胞进行瞬时表达,转染72h后收取细胞上清先用化学发光酶免分析法(CLEIA)、SDS-PAGE鉴定抗体的表达,然后再用CLEIA鉴定与腺病毒的结合活性。【结果】由于轻链的不同,分别构建了容量为3.0×109(轻链是κ)和1.8×109(轻链是λ)的抗3型、7型腺病毒的Fab噬菌体抗体库,Fab(Κ)和Fab(λ)基因插入率均接近100%。用纯化的3型腺病毒颗粒作为抗原从Fab库中筛选抗体,未筛选到与3型腺病毒特异性结合的阳性克隆;用纯化的7型腺病毒颗粒作为抗原从Fab库中筛选抗体,获得了4株与7型腺病毒特异性结合的阳性克隆,分别是5C、5D、9F、9H,型别特异性检测表明4株阳性克隆与3型、14型、55型腺病毒也有结合活性。阳性克隆进行DNA测序后在IMGT/V-QUEST数据库中进行分析比对,结果显示4株克隆序列各不相同,其中5C、9H的轻链型别是Κ,5D、9F的轻链型别是λ。4株阳性克隆的重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。5C、9H的Κ轻链可变区成功克隆入Igκ,5C、9F和9H重链可变区成功克隆入Ig H,2条轻链和3条重链组合成6个抗体,并在293T细胞表达。表达的细胞上清经CLEIA鉴定,6个抗体均得到表达,其中抗体组合2和组合5表达量相对较好,CLEIA鉴定结果显示与Adv7有结合活性。表达量相对较好的上清经SDS-PAGE鉴定,在还原和非还原状态下均未见目的条带,说明抗体表达量较低。全抗体型别特异性检测结果表明,表达量较好的抗体组合2和组合5与Adv3、Adv14、Adv55也有结合活性。【结论】成功构建了全人源特异性抗3型、7型腺病毒Fab噬菌体抗体库,筛选到4株与7型腺病毒特异性结合的抗体,并且抗体与3型、14型、55型腺病毒有结合活性。抗体序列转染293T细胞进行全抗体表达,由于抗体表达量较低,抗体活性需要进一步验证。本研究对抗腺病毒噬菌体抗体库的建立和筛选进行了各方面的探索,为未来抗3型、7型腺病毒治疗性抗体的研发提供参考和借鉴。
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【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

【参考文献】