【摘要】：随着中国人口老龄化趋于严峻,截至目前全国超过60岁以上的人口已超过2亿。伴随着人口老龄化随之而来的各种衰老产生的疾病,心血管疾病、恶性肿瘤、神经退行性疾病(阿尔兹海默、帕金森等)、脑血管病(中风等)、糖尿病等多种衰老相关疾病严重影响着老年人的生活,同时也给家庭和社会带来沉重的经济和精神上的负担,严重阻碍国家经济的发展和社会的和谐稳定。因此,研究衰老相关疾病的发病机制,治疗衰老相关疾病,甚至延缓衰老预防疾病的发生是当今我国医学科学研究需要解决的重大课题。人的衰老受多重因素影响,由于成年后人体器官趋于稳定,只有少数器官具有部分再生功能,受到环境和自身遗传因素的共同作用,机体器官产生越来越多的炎症、基因突变,最终导致细胞代谢异常乃至器官衰老功能失常。与衰老相关的基因有很多,其中SIRT1扮演着重要的角色,研究显示SIRT1在酵母中可以延长酵母的寿命[1],在动物体内也有延缓衰老延长寿命的作用[2]。进一步的研究显示,SIRT1参与细胞生命活动的多种过程,作为基因沉默调节子调节基因的表达,通过Foxo家族参与细胞氧化应激及自噬[3,4],去乙酰化p53抑制其促细胞凋亡作用[5],作为肿瘤抑制因子逆向调节c-myc和mTOR通路[6],作用于下丘脑影响生物节律和摄食行为[7-10]。总之SIRT1对细胞有多种的生物调节功能,为了对SIRT1有更多的了解,因此需要寻找SIRT1更多的相互作用蛋白。我们首先采用筛选互作蛋白的经典方法——酵母双杂交,根据需求构建了酵母双杂交系统的诱饵融合蛋白BD-SIRT1,并检测其对酵母菌株Y2HGOLD无毒性、无自激活现象后,与人源的脑组织cDNA文库进行杂交,我们最后筛选得到了 27个可能与SIRT1存在相互作用的蛋白。由于人力有限我们需要从这27个蛋白中挑选若干个蛋白进行验证并最终选择一个蛋白进行生物学功能研究。这27个蛋白中有转录因子、线粒体相关蛋白、溶酶体相关蛋白、囊泡相关蛋白和翻译相关蛋白等。由于线粒体作为细胞的能量工厂,在细胞衰老病变过程中往往伴随着线粒体功能的异常,其中神经退行性疾病如阿尔兹海默、帕金森都伴随着线粒体功能的破坏,在脑缺血再灌注过程中同样伴随着线粒体的钙超载所产生的过量超氧化物引起的细胞死亡,因此研究SIRT1与线粒体的关系成为我们关注的重点。我们得到5个与线粒体相关的候选蛋白:DCTN6、ATP5F1、MICU1、SLC25A5、MFF。经过现有的研究报道,我们重点关注MICU1。MICU1(mitochondrial calcium uptake])全名为线粒体钙摄取蛋白1,主要功能是调节线粒体内膜的钙通道MCU,使细胞在正常的情况下建立适当的钙摄取水平,维持细胞线粒体代谢的稳定性,防止细胞由于钙超载而产生过量的活性氧自由基,破坏细胞膜结构的稳定性。研究显示在MICU1稳定敲除的细胞中,细胞会产生较高水平基础钙,使细胞处于高氧化应激状态。我们知道激活SIRT1大部分时候是对细胞起保护作用,抑制SIRT1则会使细胞更易发生凋亡坏死,而且我们的实验显示SIRT1在线粒体内有表达,这与文献的报导一致。那么激活SIRT1所产生的对细胞的种种保护作用是否也通过MICU1来维持线粒体的钙稳定,这是我们接下来要研究的内容。为了验证SIRT1和MICU1相互作用的可靠性,我们先进行体外的结合实验:首先我们在Hela细胞中表达质粒MICU1-HA,然后用含蛋白酶抑制剂的PBS制取细胞裂解液备用,同时构建质粒并在细菌中表达纯化融合蛋白GST(对照组)和GST-SIRT1做pull-down实验,免疫印迹实验显示SIRT1和MICU1在体外是存在相互作用的。细胞内结合实验:我们分别在Hela细胞中表达SIRTl-flag、MICU1-HA、SIRT1-flag+MICU1-HA、SIRT1-flag+MICU1-HA 四组质粒,然后以IgG或flag抗体做免疫沉淀,我们得到的结果显示SIRT1和MICU1在Hela细胞中存在相互作用。在Hela细胞内表达质粒MICU1-HA,通过细胞免疫荧光共标实验,我们在共聚焦显微镜下可以观察到外源性的MICU1-HA和内源性的SIRT1存在共定位。在正常的细胞中SIRT1和MICU1是否也存在结合作用,为了回答这个问题,我们培养大鼠皮层神经元提取蛋白,使用SIRT1抗体做免疫共沉淀实验,结果显示SIRT1和MICU1在神经元内存在相互作用,在神经元内表达MICU1-HA质粒并以HA和SIRT1抗体做免疫荧光共标实验,结果显示SIRT1和MICU1存在共定位。综和以上的结果,我们认为SIRT1和MICU1在细胞内和细胞外存在相互作用。那么SIRT1和MICU1的结合作用具有什么样的生物学功能呢?我们知道MICU1主要的功能是调节线粒体的钙摄取,那么SIRT1是否通过MICU1调节线粒体的钙摄取?首先我们需要确定SIRT1对线粒体钙是否存在影响。通过抑制或激活SIRT1的活性观察其对线粒体钙摄取的影响,使用DMSO做对照,10μ 白藜芦醇(resveratrol)作为 SIRT1 的激动剂,10mmM 烟酰胺(NAM)和 10μM EX527作为SIRT1的抑制剂,分别提前1h处理细胞,然后孵浴线粒体钙染料/AM半小时后洗去染料并于共聚焦显微镜下观察Rhod-2荧光强度(代表线粒体基质内的钙浓度),记录1分钟基础值后使用100μ 组胺(histamine)诱导线粒体钙内流,观察的结果显示:在未诱导钙内流的情况下各组荧光强度DMSO组为33.647±10.93%,NAM 组为 39.553± 16.89%,EX527 组为 46.077± 19.73%,Resveratrol组为32.73±11.37%,各组间无显著性差异,这说明在无外界刺激的情况卜下抑制或激活SIRT1的活性对线粒体的基础钙摄取无影响,但是在组胺诱导钙内流的情况下,各组的钙信号水平DMSO组为107.78±9.36%,NAM组为173.27±7.31%,EX 527 组为 185.92士 17.44%,Resveratrol 组为 122.29± 17.58,NAM、EX527和Resvertarol组分别与DMSO对照组进行比较,使用SIRT1抑制剂的两组NAM(p0.05)和EX527(p0.05)显著增加钙内流的幅度,这说明抑制SIRT1活性使得钙大量内流时线粒体对钙的摄取失去了正常的控制能力,线粒体钙离子通道开放量增加。同样我们使用shRNA干扰SIRT1的表达,无刺激的情况下线粒体钙浓度:对照组shNC(68.541±5.34%)和SIRT1干扰组(61.648±5.59%)无显著性差异;在histamine诱导钙内流的情况下对照组shNC(90.295±2.83%)和SIRT1干扰组(121.835±2.83%)(p0.05)对比具有显著性差异。因此我们得出结论,SIRT1是可以影响线粒体对钙的摄取的,至少在外界因素刺激下引起的钙过载,抑制SIRT]会增强这个过程,这可能使线粒体因过量的钙导致线粒体钙超载,引起线粒体的溶解破裂,诱导细胞的凋亡坏死,这与目前的研究结论相吻合,即多数情况下抑制SIRT1的活性不利于细胞在外界刺激环境下存活。那么SIRT1对线粒体的这种作用是不是通过MICU1起作用的?为了验证这个问题,我么首先在Hela细胞内表达MICU1-HA、,24小时后两组细胞都提前1小时处理的EX527抑制SIRT1的活性,然后在共聚焦显微镜下检测线粒体内钙浓度,结果显示过表达MICU1-HA组和PCMV-HA(对照组)的Hela细胞中,线粒体钙水平在使用组胺诱导钙内流前无显著差异,这说明过表达M1CU1在正常情况下对线粒体的钙摄取水平无影响,与文献的报导一致,同时在诱导钙超载的过程中过表达MICU1组所产生的最大钙浓度(90.665±4.78%)显著低于对照组(157.819±3.87%)(p0.05),这说明了抑制SIRT1所产生的钙超载增强现象部分是通过MICU1介导的。我们知道SIRT1作为NAD依赖的去乙酰化酶家族的成员,其主要发挥生物学功能的方式是通过对底物的去乙酰化来调节底物的活性实现的,那么MICU1是否作为SIRT1的去乙酰化底物呢?我们在Hela细胞中表达MICU1-HA,24小时后分别处理DMSO(对照)和10 μ M EX527,再使用HA抗体将MICU1-HA纯化出来,western检测两组样品中MICU1的乙酰化程度,发现没有明显的变化,因此我们推断MICU1不是SIRT1的去乙酰化底物。综上所述,在Hela细胞和神经元内SIRT1可以直接和MICU1相互作用,同时抑制SIRT1的活性可通过MICU1增强线粒体在组胺诱导钙超载下的钙内流强度,使细胞更易于钙超载,但是SIRT1并不是通过对MICU1的去乙酰化来调节它的活性。我们的发现揭示了 SIRT1调节生物过程的新机制,为寻找新的药物靶点提供的新的方向。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3416
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