田鼠巴贝虫棒状体相关蛋白的基因筛

发布时间：2018-11-18 07:13

【摘要】：田鼠巴贝虫(Babesia microti)是一种寄生在红细胞内人兽共患的血液原虫,传播媒介是蜱,主要通过蜱虫叮咬和血液传播。该虫属于顶复门(Phylum Apicomplexa)、孢子虫纲(Class Sporozose)、梨形虫亚纲(Subclass Prioplasmasina)、梨形虫目(Order Prioplasmasina)、巴贝虫科(Family Babesidae)。它与其它顶复门原虫具有相似的亚细胞结构并能分泌与入侵相关的保守蛋白,尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的棒状体相关蛋白(rhoptry-associated protein,RAP)被认为是抵抗寄生虫入侵和繁殖的关键分子,该蛋白在虫体入侵的纳虫空泡形成过程中发挥了重要作用。同时以往研究指出其他巴贝虫棒状体相关蛋白是该病的候选诊断抗原和疫苗,但是关于田鼠巴贝虫棒状体相关蛋白的研究较少,因此本研究致力于棒状体相关蛋白的制备及免疫性能分析,旨在为后续相关研究奠定基础。目的本研究旨在通过筛选不同数据库获得田鼠巴贝虫棒状体相关蛋白(Babesia microti rhoptry-associated protein,BmRAP)的基因序列和氨基酸序列;经过生物信息学分析确定截短表达蛋白序列,重组表达得到纯化的C-BmRAP和N-BmRAP;免疫BALB/c鼠,验证该蛋白的抗感染免疫效应,为后续研究奠定基础。方法通过筛选 NCBI、Uniprot、EMBL-EBI、GeneDB 以及 PiroplasmaDB 专业网站,搜索BmRAP目的基因;经过生物信息学分析,了解蛋白基本理化性质、信号肽、跨膜区和抗原表位等性质,确定截短表达的C-BmRAP和N-BmRAP基因序列,构建系统发育进化树,分析其亲缘关系及基因保守性;利用原核表达系统,设计引物,构建重组载体,体外克隆表达C-BmRAP和N-BmRAP重组蛋白并进行纯化;用纯化后重组蛋白免疫BALB/c鼠,三次免疫后感染田鼠巴贝虫,薄血片记录小鼠感染巴贝虫密度,测量小鼠体重及其脾脏重量,血液血常规分析及细胞因子检测评价重组蛋白C-BmRAP和N-BmRAP抗感染免疫效果。结果1)在EMBL-EBI和PiroplasmaDB中各筛选出1条田鼠巴贝虫棒状体相关蛋白基因,登录号分别为XP_012649548和BBM_Ⅲ04695。通过软件APE进行序列比对,两个基因序列完全一致,证明为同一条基因序列。该基因共含有4 443 bp,可编码1 480个氨基酸。编码蛋白分子量为165.31KDa,为分泌蛋白,含 1 个信号肽,4 个跨膜区(7-29aa/1 256-1 278aa/1 377-1399aa 和 1 414-1433aa),并含有较多抗原表位,且系统进化分析揭示其与顶复门其他虫种RAP具有亲缘关系,同源性分析结果BmRAP与BbRAP和BdRAP的同源性分别为68%和67%。2)通过生物信息学蛋白结构及抗原表位分析,最终确定了 C-端截短和N-端截短的田鼠巴贝虫棒状体相关蛋白(即C-BmRAP和N-BmRAP)基因序列,并成功构建了原核表达载体,蛋白诱导表达经纯化后获得较高纯度的重组C-BmRAP和N-BmRAP蛋白。3)动物三次免疫,田鼠巴贝虫入侵感染后,重组C-BmRAP和N-BmRAP蛋白免疫组和正常对照组的全血涂片计数结果在感染第7d,N-BmRAP、C-BmRAP免疫组和对照组红细胞感染率分别为30%、28%和50%,蛋白免疫组感染率低于对照组;血常规检测结果中,白细胞(White Blood Cell,WBC)在各组间无明显差异(F= 1.842,P0.05);在感染第7天,红细胞(Red Blood Cell,RBC)数量降到最低(N-BmRAP和C-BmRAP蛋白免疫组和正常对照组RBC分别为(5.70±3.46)×1012/L、(4.72±1.36)×1012/L、(3.42±1.09)×1012/L),RBC的检测结果在各组间有明显差异(F=8.096,P0.05)。4)从脾脏形态上看,重组蛋白免疫以后小鼠脾脏肿大,感染B.m后小鼠脾脏更大,对照组在感染14d脾脏长度最大,C-BmRAP和N-BmRAP蛋白免疫组小鼠脾脏变化无对照组明显;在感染B.m后第7d,TNF、IFN-γ和IL-10比处理前含量增加,IL-2、IL-4、IL-6和IL-10无明显增加;在感染后第21d,只有TNF无明显高峰,其余指标居于高峰状态。结论1)采用生物信息学方法预测田鼠巴贝虫棒状体相关蛋白含有较多的抗原表位,该蛋白可作为疫苗的候选分子。2)克隆表达了 C-端截短和N-端截短的田鼠巴贝虫棒状体相关蛋白,经纯化后获得较高纯度的重组蛋白,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。3)C-BmRAP和N-BmRAP蛋白免疫组和正常感染组的血液涂片及血液学指标结果显示N-BmRAP有较好的近期免疫保护作用,C-BmRAP免疫保护能力相对较弱,N-BmRAP可用于进一步的疫苗研究。4)细胞因子检测结果显示C-BmRAP和N-BmRAP可刺激机体产生免疫反应,该蛋白具有一定的免疫保护力,可以作为田鼠巴贝虫疫苗的候选靶标。
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【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R382

【参考文献】