【摘要】：目的Stephanthraniline A(STA)是我们课题组前期从中药黑鳗藤Stephhanotis mucronata中经化学分离和活性筛选发现的具有较好免疫抑制活性的天然C21甾体化合物。本研究的目的是进一步对STA抑制T细胞免疫反应的作用进行评价,并对其机制进行深入研究。方法1.STA体外对T细胞活化和增殖的影响:采用Nylon Fiber Column T从小鼠脾细胞中分离纯化T细胞。以抗CD3/CD28诱导T细胞活化和增殖,经STA作用后,MTT法测定细胞增殖;ELISA和RT-PCR法测定细胞因子的蛋白分泌和mRNA表达;流式细胞仪测定细胞周期分布。2.STA体外对CD4+T细胞活化和增殖的影响:以Dynabeads从小鼠脾细胞中分离纯化CD4+T细胞。Concanavalin A(Con A)诱导CD4+T细胞活化和增殖,经STA作用后,流式细胞仪测定表面分子CD25和CD69表达。CFDASE示踪法测定CD4+T细胞增殖指数。ELISA和Realtime-PCR法测定细胞因子的蛋白分泌和mRNA表达。3.STA抑制T细胞活化的机制研究:采用糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)拮抗剂RU486观察STA的作用是否依赖于GR受体。采用EMSA法测定STA对转录因子AP1、NFKB及NFAT和DNA结合能力的影响。Western blot法测定STA对NFAT1、IKBα、p38、ZAP-70,PKCθ蛋白及其磷酸化的影响。通过观察Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)/lonomycirn或PMA/抗CD28诱导的T细胞活化和增殖确定STA的作用是否依赖于T细胞受体(T cell receptor,TCR)近端信号和Ca2+信号。采用计算机模拟分子对接方法测试STA与PKC蛋白(α、βⅡ、ε、η、θ)之间的相互作用。采用ADP-GIo-rM激酶检测法观察STA对PKCθ活性的影响。采用PKCθ激动剂PMA观察其是否能抑制STA的免疫抑制作用。采用Signal Transduction PathwayFinder PCR观察STA对多重信号传导通路的影响。4.STA对Con A诱导的小鼠爆发性肝炎的影响:STA腹腔注射1h后尾静脉注射Con A诱导小鼠产生爆发性肝炎。8h后,检测小鼠体重变化。收集血清按ELISA法测定TNF-α,IL-1β、IFN-γ和IL-17的浓度。按ALT和AST检测试剂盒说明测定转氨酶活性。肝脏组织切片后苏木精-伊红染色观察组织病理变化情况。部分切片以FITC-anti-CD4、PE-anti-CD69标记免疫荧光染色观察CD4+CD69+阳性细胞的数量。根据体重、血清中ALT和AST水平及炎症因子(TNF-α和IL-1β)含量变化和组织病理变化情况评价STA对爆发性肝炎的治疗作用。根据肝组织CD4+CD69+阳性细胞数,细胞因子(IFN-γ和IL-17)含量评价STA体内对CD4+T细胞在小鼠肝组织内活化和聚集的影响。5.STA和Cyclosporine A(CsA)协同抑制T细胞免疫应答的体内外研究:采用非有效浓度的STA和CsA联合使用观察它们体外对Con A诱导的T细胞免疫应答反应的影响。MTT法测定细胞毒性和细胞增殖指数。ELISA法测定细胞因子IL-2的的分泌量。流式细胞仪测定CD25的表达情况。采用二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)诱导的小鼠迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity,DTH)模型观察非治疗剂量的STA和CsA联合使用对T细胞免疫应答的体内作用,以耳廓的肿胀程度和的组织病理变化情况评价STA和CsA的协同作用。最后采用P450-GIoTM CYP3A4筛选系统测定STA对CsA代谢酶CYP3A4活性的影响。结果1.STA体外抑制T细胞的活化和增殖:STA能显著抑制抗CD3/CD28诱导的T细胞增殖,抑制T细胞进入S和G2/M期,抑制细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17的蛋白分泌和mRNA表达。2.STA体外抑制CD4+T细胞的活化和增殖:STA能显著抑制Con A诱导增殖的T细胞中的CD3+ CD4+T细胞的比例,但对CD3+ CD8+ T细胞的比例没有明显的抑制作用;能明显抑制Con A诱导的CD4+T细胞增殖;抑制表面分子CD25和CD69的表达;抑制细胞因子IL-2和IFN-γ的蛋白分泌和mRNA表达。3.STA抑制T细胞活化的机制:糖皮质激素受体拮抗剂RU486不能阻断或减弱STA的作用。STA并不会扩大sub-G1凋亡峰,也不影响抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的mRNA表达。STA抑制转录因子AP1、NFKB及NFAT和DNA的结合能力,抑制NFAT的去磷酸化以及IkB-α和p38的磷酸化。STA对Zap70的磷酸化没有明显的影响,对PMA/lonomycin或PMA/抗CD28诱导的T细胞活化和增殖均具有显著的抑制作用。STA通过5个氢键结合于PKCθ的ATP口袋域,STA能抑制PKCθ的活性,抑制CD4+T细胞内的PKCθ磷酸化水平。STA对Con A诱导的T细胞活化和增殖作用不能被PMA逆转。STA能调节18条信号通路中Wnt、Hedgehog、Jak-Stat等10条通路相关基因的mRNA表达。4.STA缓解Con A诱导的小鼠爆发性肝炎和CD4+T细胞在小鼠肝组织内活化聚集:STA能明显恢复Con A引起的体重降低、缓解血清ALT和AST水平上升和肝组织病变,明显抑制血清中TNF-α和IL-1β的含量。另外,STA能抑制肝组织中CD4+CD69+T细胞的数量,抑制细胞因子IFN-γ和IL-17的产生。5.STA和CsA协同抑制T细胞免疫应答:低浓度的STA和CsA单独使用或联合使用均不会对正常脾细胞产生细胞毒性。单独使用低浓度的STA或CsA不能抑制Con A引起的T细胞增殖,IL-2产生和CD25表达,但STA和CsA联合使用后均具有显著抑制作用。同样地,非治疗剂量的STA和CsA联合口服给药后能明显抑制DNFB诱导的小鼠耳肿胀,减少小鼠耳廓表皮增生和浮肿,以及炎症细胞的浸润。STA能抑制CYP3A4的活性。结论1.STA体外能抑制T细胞的激活和增殖,且对CD4+T细胞亚型的抑制作用比CD8+T细胞敏感。2.STA可通过阻止细胞进入分裂周期抑制T细胞的增殖,但不会促进激活诱导的T细胞凋亡。3.区别于传统甾体类抗炎药物,STA与GR无竞争性结合,不依赖于GR起免疫抑制作用。4.区别于钙调蛋白酶抑制剂(calcineurininhibitors,CNls),STA抑制T细胞激活不是通过TCR近端信号和Ca2+信号。5.PKCθ极可能是STA作用的分子靶点。STA可通过氢键结合的方式连接于PKCθ的ATP 口袋域,从而抑制PKCθ的磷酸化和活性,进而抑制PKCθ下游NFAT、NFκB和MAPK信号级联传递,最终抑制T细胞的活化。6.STA抑制T细胞活化和增殖还可能与其调控多重信号通路的传导有关。7.腹腔注射或口服给予STA在体内对T细胞介导的免疫性疾病模型均显示较好的治疗作用。STA通过抑制CD4+T细胞活化和在肝脏聚集,从而缓解Con A诱导的爆发性肝炎。8.STA与CsA可通过互补的分子机制,或可能提高CsA的体内生物利用度,在体内外发挥协同作用。以上结果为STA作为用于治疗T细胞介导的炎症和自身免疫性疾病的免疫抑制先导化合物的研究奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392
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本文编号：
2341321
