【摘要】：中心体是动物细胞和低等植物细胞内的一种重要的无膜结构的细胞器。在细胞分裂过程中负责两极的建立,确保细胞分裂过程的对称性,保证了细胞分裂进程中遗传物质的平均分配。在电镜下,中心体由一对互相垂直排列的中心粒及致密度很高的中心粒周围物质所组成。其功能的发挥主要依靠中心粒周围物质内的蛋白。目前,中心体蛋白在有丝分裂中的定位和功能研究已经取得了很多成果。按照这些蛋白在有丝分裂中发挥功能的阶段,大致可以分为四类:第一类参与了间期细胞的中心粒复制,中心粒复制始于G1晚期或S早期,完成于S期;第二类参与了细胞周期G2/M的转换,通过与Cdk1的相互作用启动有丝分裂;第三类在前期直接参与了纺锤体微管的组装,第四类则参与了有丝分裂末期胞质的分裂。但是在没有中心体形成的减数分裂进程中,中心体蛋白能否发挥功能,其功能与有丝分裂中的功能有何异同,仍然是没有涉及的领域。本课题针对以上相关问题,利用小鼠的未成熟卵母细胞,参照NCBI的数据,从以上四类中心体蛋白中,各选取一种在卵母细胞内表达量较高的蛋白,研究其在卵母细胞体外成熟不同阶段中的表达和定位,采用基因敲减和或过表达技术,阻遏或增强他们的表达,从而探索其在卵母细胞体外成熟中的功能。本研究分为三个部分,分别研究了这几种蛋白的定位及功能。其中Cep70因基因敲减后对卵母细胞的GVBD率和PB1排出率没有影响,放弃对其进行定位和功能的研究。第一部分Cep蛋白在卵母细胞体外成熟进程中的表达及定位目的:确定中心体蛋白Cep55在卵母细胞体外成熟不同阶段的表达及亚细胞定位,了解其对卵母细胞体外成熟进程的影响。方法:1.用Western blotting方法检测四类蛋白在卵母细胞体外成熟四个重要阶段中的表达情况;2.用荧光染色和活细胞显像的方法,确定四类蛋白在卵母细胞体外成熟几个重要阶段中的亚细胞定位;结果:1.表达量:在卵母细胞减数分裂四个重要阶段(间期,第一次减数分裂前期,第一次减数分裂中期,第二次减数分裂中期),这四种蛋白的表达量都是恒定不变的。2.亚细胞定位:在间期,这三种蛋白均定位于卵母细胞的细胞质内,接近中心的位置,但是Cep55在星体上也有定位;在减数分裂开始后,这三种蛋白都开始散布于细胞质内,在第一次和第二次减数分裂中期,这三种蛋白在纺锤体两极都有定位,且与γ-tubulin有部分重叠;但Cep63主要定位于两极,Cep120在纺锤体上有少量定位,Cep55则分布在整个纺锤体,且在胞质分裂阶段定位于中体。结论:Cep蛋白家族成员在有丝分裂与减数分裂中的表达模式和定位具有相同和不同之处。第二部分四种Cep蛋白的敲减/过表达对卵母细胞GVBD和PB1排出的影响目的:确定四类中心体蛋白是否影响卵母细胞的GVBD和PB1排出方法:1.用特异性Si RNA/Morpholino注射的方法进行基因敲减,检测基因敲减后这四类蛋白的表达水平;2.用特异性Si RNA/Morpholino注射的方法进行基因敲减,,体式镜下观察这四类蛋白对卵母细胞GVBD率及第一极体排出率的影响。结果:1.四种中心体蛋白基因敲减效果良好;2.四种中心体蛋白的敲减均未引起卵母细胞GVBD率的变化;除Cep70的敲减未引起改变外,其他三种蛋白的敲减均引起卵母细胞PB1排出率的降低。结论:Cep蛋白家族的某些成员在减数分裂过程中起到重要作用。第三部分Cep蛋白敲减/过表达对卵母细胞第一次减数分裂中期纺锤体组装及中后期转换的影响目的:确定三种中心体蛋白对卵母细胞体外成熟进程重要进程的影响方法:1.用荧光染色的方法,确定Cep蛋白的敲减/过表达是否影响卵母细胞MI纺锤体的形态和染色体排列,初步探讨其引起纺锤体形态改变的机制。2.用Western blotting确定Cep蛋白的敲减对中后期转换时cyclin B1表达水平和同源染色体分离的影响,初步探讨其影响极体排放的原因。3.利用染色体铺片的方法,确定Cep蛋白敲减后引起PB1排出率降低的机制。结果:1.三种蛋白的敲减都引起卵母细胞MI纺锤体的形态异常,但在Cep55和Cep120敲减引起的异常中以纺锤体极性损害为主,Cep63敲减引起的异常更加明显,不仅引起极性的损害,还引起纺锤体形态更多的异常及染色体排列的异常。Cep55的过表达未引起纺锤体形态的变化,Cep120的过表达则引起多极纺锤体的产生。2.三种蛋白的敲减均引起纺锤体极性的损害——γ-tubulin的解聚3.三种蛋白的敲减均引起中后期转换的障碍:cyclin B1不降解,同源染色体不分离。4.三种蛋白敲减后均引起纺锤体检验点的激活,结论:三种蛋白进行基因敲减后纺锤体检验点的激活阻遏中后期转换,从而引起PB1排出率降低。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R321
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