河弧菌中Ⅵ型分泌系统组成及功能性表达研究

发布时间：2018-11-19 13:31

【摘要】：河弧菌(Vibrio fluvialis)作为一种新近出现的食源性病原菌,正在逐渐成为一个新的公共卫生问题。河弧菌能够引起急性腹泻的散发和暴发,偶尔也会有肠道外感染病例的报道。河弧菌感染的临床症状与霍乱有些相似,能够引起病人的水样腹泻。目前,对于河弧菌的生存特点与治病机制的了解,仍然很有限。Ⅵ型分泌系统(T6SSs)是一种新近发现的细菌分泌系统,在很多革兰阴性菌中均有被发现。T6SSs常常被认为与细菌的致病力有关,其机制是通过将毒力蛋白注射到宿主细胞或外环境的与其竞争的其他细菌中,引起靶细胞的死亡,从而获得竞争优势。在本次研究中,我们根据之前的研究和全基因组测序结果,还有PCR实验验证,明确了 VF85003的两个T6SS基因簇(VflT6SS1和VflT6SS2)详细的基因、组成结构及其侧翼区序列,同时也鉴定出了三个“独立”的hcp-vgrG同源基因簇。我们选择了 34株野生河弧菌分离株,依据85003基因组中VflT6SS1和VflT6SS2基因簇,使用叠瓦片式的方式设计引物,利用PCR扩增野生河弧菌中的T6SS基因簇。结果显示VflT6SS2内各基因片段的检出率高于VflT6SS1,提示在野生河弧菌中,VflT6SS2基因簇的分布可能比VflT6SS1更广泛。在PCR验证实验中,在某几个野生株里,VflT6SS2的tssG2-tagH2、tssJ2-tssK2、或vasI-tssA2,或vasH-vasI、vasI-tssa2或tssM2-vasL并未被检出,可能是由于各野生株间遗传背景有差异或基因有突变等原因。Hcp和VgrG既是T6SS的结构蛋白,也能够作为效应子被分泌出去。通过检测Hcp蛋白的分泌来判断T6SS是否有功能活性,是一种常用的T6SS研究方法。在本次研究中,我们发现,VflT6SS2_Hcp的表达是受温度影响的。在常规培养条件下,VflT6SS2在25℃和30℃有组成型表达,在高温(37℃)下没有表达活性,这提示VflT6SS2可能对于细菌在水生环境中的生存具有重要意义。我们收集了 OD600值在0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.8和过夜的菌液,结果显示Hcp蛋白在过夜前的菌液中均有表达,但只在OD600为1.0-2.0这一阶段能够分泌出去,说明VflT6SS2_Hcp的分泌也呈生长阶段依赖性的。我们在不同的河弧菌野生株中检测了 VflT6SS2_Hcp的表达和分泌,结果显示,在常规培养条件下,除了 VF42没有分泌Hcp蛋白,其他野生株均表现出VflT6SS2的活性。我们的研究发现增加盐浓度(NaCl的浓度从170 mM到855 mM)或者使用高的等渗透压KC1溶液、蔗糖溶液、海藻糖溶液或甘露醇溶液(相当于340mM的NaCl溶液)在常规培养条件下,能够很明显的刺激Hcp的分泌,这表明渗透压也能够调控VflT6SS2的功能。而且,我们发现尽管VflT6SS2在37℃、常规培养条件下是没有活性的,但如果使用高盐浓度(513 mM到855 mM的NaCl),还是能够激活VflT6SS2,这一结果也提示了 VflT6SS2可能在感染宿主内的特定条件下是能够发挥功能的。最后,我们的杀菌实验结果显示VflT6SS2的功能性表达与抗菌活性有关。vasH作为T6SS的全局调控子,它的缺失能够影响Hcp的表达与分泌,进而影响VflT6SS2介导的细菌杀菌活性。VflT6SS2的三个Hcp效应子的杀菌实验的结果显示,TssD2_a和TssD2_b的缺失对细菌杀菌能力的影响很有限,但它们的双缺失株却极大地降低了细菌的杀菌能力,这表明TssD2a和TssD2b在功能上冗余的,但对于VflT6SS2介导的抗菌活性是必须的。TssD2c的缺失对于细菌杀菌的影响很有限,这也提示TssD2c可能对于VflT6SS2介导的杀菌活性是非必需的。85003中另一个T6SS基因簇VflT6SSl,在常规培养条件下,基因的mRNA表达水平很低,说明VflT6SS1在常规培养条件下未对细菌杀伤能力有贡献。总之,我们的研究提示了 VflT6SS2能够给予河弧菌在海洋环境中获得竞争优势,它的活性能够被如温度和盐浓度等环境信号所调控。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378

【相似文献】