【摘要】：免疫球蛋白M（IgM）是人的免疫球蛋白之一，根据结构的不同将免疫球蛋白分为五种，其他还有lgA、lgG、IgD和lgE。IgM占血清免疫球蛋白总量的5%-10%，是分子量最大的Ig，一般不能通过血管壁，主要存在于血液中。IgM也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，是机体抗感染的“先头部队”，血清中检出IgM提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。在感染过程中IgM首先出现，但持续时间不长，是近期感染的标志。 IgM分子包括重链μ链和轻链λ，轻链是各类免疫球蛋白共有，重链μ链是IgM分子所特有的，已有研究表明抗人IgMμ链单克隆抗体可用于多种感染性疾病的早期诊断以及免疫学的研究。但是用于制备抗人IgMμ链单克隆抗体的天然的IgMμ链来源少，制备方法繁琐，价格较高，而且IgMμ链本身易降解。因此，本研究利用基因工程技术，通过重组构建、原核表达IgMμ链恒定区各肽段，并对其免疫原性进行检测，以期得到免疫原性同天然IgMμ链相近的肽段，能够进一步用于制备抗人IgMμ链单克隆抗体。 本研究分为一下两个部分：第一部分基因合成以及原核表达IgMμ链恒定区各肽段 分析IgM的结构，IgM的重链有一个可变区（VH）和四个恒定区（CHl、CH2、CH3和CH4）共五个功能区。VL和VH是与抗原结合的部位，单体由一对L链和一对H链组成的基本结构，有2个与抗原结合的位点，共分为可变区和恒定区，H和L链上都有可变区，同类重链和同型轻链的近N端约110个氨基酸序列的变化很大，其他部分的氨基酸序列相对恒定，据此可将轻链和重链区分为可变区（V）和恒定区（C）。IgM分子包括重链μ链和轻链λ，轻链是各类免疫球蛋白共有，重链μ链是IgM分子所特有。 通过GenBank数据库查询的到人IgMμ链恒定区完整的氨基酸序列，根据GenBank数据库IgMμ链恒定区（CH1-CH4）的cDNA序列并进行必要的大肠杆菌密码子优化，本研究构建了并原核表达了IgMμ链恒定区3个肽段。具体方法如下：分别获得IgMμ链（CH1-CH4）、 IgMμ链（CH1-CH2）、 IgMμ链（CH3-CH4）基因片段，利用重叠延伸PCR (Overlap Extension Ploymerase Chain Reaction，OE-PCR)体外基因合成人IgMμ链恒定区全长（CH1-CH4）及其截断片段CH1-CH2和CH3-CH4。用T/A克隆法将各片段克隆至pMD18-T载体进行测序。将测序正确的序列分别克隆到原核表达载体pPET-32a，构建其原核表达质粒：PET32a-rMμCH1-CH4， PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4，将上述原核表达质粒分别转入E. coli BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达，获得3种截短的IgMμ链恒定区融合蛋白ET32a-rMμCH1-CH4， PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4，其相对分子量分别约为：69.8KD、43.8KD、46.9KD并用Ni-NTA亲和层析法纯化目的融合蛋白。通过12%SDS-PAGE电泳分析，分别可见分子量约为69.8KD、43.8KD、46.9KD左右的特异的条带，大小与理论值相符。表明本研究成功构建并表达出PET32a-rMμCH1-CH4，PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白。第二部分重组蛋白免疫原性分析及与天然人IgM、 IgMμ链和IgG比较 用PET32a-rMμCH1-CH4，PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白分别免疫BALB/c小鼠，制备小鼠抗血清，用以观察诱导产生针对IgMμ链的特异性抗体情况；用天然的人IgM、 IgMμ链和IgG免疫BALB/c小鼠，制备小鼠抗血清，以检测融合蛋白PET32a-rMμCH1-CH4， PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4诱导产生产生针对IgMμ链的特异性抗体于天然IgM、IgMμ链之间的差异，以及天然的人IgM、 IgMμ链和IgG之间交叉反应性。 ELISA检测结果显示，上述PET32a-rMμCH1-CH4， PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白均可以与天然的IgM、 IgMμ链特异性反应，表明重组蛋白具有与天然IgMμ链的反应能力，保留了IgMμ链的免疫原性。然而，重组蛋白的免疫原性较天然的IgMμ链稍弱，诱导产生的抗体滴度稍偏低，（取对数后抗体滴度为3.2-2），而天然的IgMμ链诱导产生较高的抗体滴度（取对数后抗体滴度为4.5），，提示截断表达IgMμ链可能对其免疫原性产生影响。其次天然的人IgM、 IgMμ链和IgG免疫产生的抗血清，IgM免疫的血清与IgG有较强的交叉反应性，同样IgG免疫的血清与IgM也存在较强的交叉反应性；与IgM不一样的IgMμ免疫的血清与IgG交叉反应弱。 总结： 1.本研究成功构建3种IgMμ链重组肽段的原核表达质粒并经E.coli表达，获得了3种截短的IgMμ链3个肽段的重组蛋白。 2.所构建的3种蛋白PET32a-rMμCH1-CH4，PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4均较好的保留了IgMμ链的免疫原性，诱导出较高滴度的针对IgMμ链的特异性抗体，提示重组的3各肽可能可以代替天然的IgMμ链，成为制备抗IgMμ链单克隆抗体的原料。为利用基因工程探寻天然IgMμ链的代替品奠定了基础。 3.用天然的人IgM、IgMμ链和IgG免疫BALB/c小鼠，制备小鼠抗血清，IgM免疫的血清与IgG有较强的交叉反应性，IgG免疫的血清与IgM也存在较强的交叉反应性；与IgM不一样的IgMμ链免疫的血清与IgG交叉反应弱。而重组的PET32a-rMμCH1-CH4，PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白与IgG无明显的交叉反应，提示抗IgMμ链的单克隆抗体比抗IgM的单克隆抗体更具特异性，在临床感染性疾病的早期诊断和免疫学的研究就中更加的精确，重组的PET32a-rMμCH1-CH4, PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4融合蛋白较好的保留了IgMμ链这一特征，初步的研究结果为进一步的分析和筛选临床用于检测和基础研究的单克隆抗体提供了一定的实验依据。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R73-3
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2362933
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