基于“通督启神”法探讨不同针刺干预对AD模型动物的作用差异与机制

发布时间：2018-12-07 07:12

【摘要】：目的本研究旨在探索“通督启神”法指导下的不同针刺干预方法对8月龄SAMP8快速老化小鼠的作用差异,以期为临床选择不同针刺干预方法治疗老年痴呆提供客观的科学依据；并在此基础上,探讨“通督启神”针法干预8月龄SAMP8快速老化小鼠在脑内海马区改善神经炎性方面可能的作用机制,以期揭示“通督启神”针法发挥治疗效用的机理。方法选用8月龄SAMP8快速老化小鼠60只,按随机数字法分为老年痴呆组(AD)、药物治疗组(M)、针刺治疗组(A)、针药结合组(MA)、脉冲电针组(EA)、音乐电针组(MEA)6组,每组10只,同背景正常老化小鼠SAMR1小鼠10只为正常对照组(N)。N组：相同饲养条件下不做任何处理,但要在其他组治疗时,抓取一次,并用相同鼠套进行束缚,以保证处理条件相同,每天1次,共15天。AD组：干预方法同空白组。M组：按0.65μ g/g体重灌胃给药,并在灌胃给药结束后用相同鼠套进行束缚,以保证处理条件相同,每天1次,共15天。A组：选取百会穴、印堂穴、人中穴三个穴位。人中穴采用快速点刺方法。点刺结束后,相同鼠套将小鼠固定好,百会穴向下、印堂穴向上平刺进针,进针深度为0.5cm,胶带固定,留针20min,每天1次,共15天。MA组：在灌胃给药结束后,依照针刺治疗组干预方法进行干预。EA组：穴位选取与进针深度同针刺治疗组,进针固定后,针柄连接韩式电针仪,疏波,电针频率为2Hz,电压为2V,电流强度为0.1mA,针刺强度以小鼠头部微颤为宜。每次治疗20min,每天1次,共15天。MEA组：穴位选取与进针深度同针刺治疗组,进针固定后,针柄连接音乐电针仪,选取“痴呆治疗”的音乐处方,电流强度以小鼠保持安静,不挣扎撕咬为宜。每次治疗20min,每天1次,共15天。15天治疗结束后,运用Morris水迷宫实验对各组小鼠进行行为学检测；运用Micro-PET对各组小鼠不同脑区葡萄糖代谢水平进行检测；运用苏木精-伊红染色观察各组小鼠海马齿状回神经元形态与排列情况；采用免疫组织化学方法观察各组小鼠海马区A β1-42表达情况,及NLRP3炎性小体相关蛋白(NLRP3、 ASC、Caspase-1、 IL-1β)的定性表达；采用Western blot分析各组小鼠NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3 Caspase-1、IL-1β)的相对表达含量。结果1,Morris水迷宫结果显示：各组逃避潜伏期：与N组相比较,从训练第1天至第5天,其余各组的逃避潜伏期均高于N组(P0.05)。与AD组相比较,从训练第1天至第5天,M组、A组、MA组、EA组、MEA组的逃避潜伏期均低于AD组；在训练的第1天,MA组的逃避潜伏期就明显低于AD组(P0.05)：在训练的第4天与第5天,MA组、EA组、MEA组的逃避潜伏期均明显低于AD组(P0.05)。穿越平台次数、目标象限游泳距离比与目标象限游泳时间比：A组、MA组、EA组、MEA组均优于AD组(P0.05),且MA组、EA组、MEA组分别在与目标象限游泳时间比、穿越平台次数中优于M组(目标象限游泳时间比：MA组P0.05、EA组P0.05、MEA组P0.01;穿越平台次数：MEA组P0.05)。2. Micro-PET结果显示：海马区18F-FDG每克组织摄取率情况：与N组相比较,AD组与M组海马区FDG每克组织摄取率明显低于N组(P0.01)。同AD组相比较,A组、MA组、EA组与MEA组海马区18F-FDG每克组织摄取率均明显高于AD组(P0.01)。同M组相比较,MA组、EA组与MEA组海马区18F-FDG每克组织摄取率均明显高于M组(MA组、EA组P0.05;MEA组P0.01)。额叶18F-FDG每克组织摄取率情况：与N组相比较,其余各组小鼠额叶对于18F-FDG的每克组织摄取率均低于N组(AD组、M组、A组、MA组与EA组P0.01；MEA组P0.05)。顶叶18F-FDG每克组织摄取率情况：与N组相比较,其余各组小鼠顶叶对于18F-FDG的每克组织摄取率均低于N组(AD组、M组、A组与MA组P0.01；EA组与MEA组P0.05)。3.HE染色结果显示：正常对照组小鼠海马齿状回颗粒细胞层颗粒细胞排列有序、紧密,胞体呈卵圆形,染色清楚且均匀,细胞核呈圆形,核仁清晰,基本没有核仁固缩现象；分子层与多形细胞层亦排列整齐。老年痴呆组：首先,分子层细胞排列松散；其次,颗粒细胞层中颗粒细胞排列散乱,不规则,胞体形状不规则,并出现大量细胞的核仁固缩,细胞浆深染；再次,多形细胞层中细胞排列紊乱,部分细胞出现核仁固缩现象。将药物治疗组、针刺治疗组、针药结合组、脉冲电针组及音乐电针组小鼠海马齿状回HE染色结果同老年痴呆组相比较,可见海马齿状回颗粒细胞层中颗粒细胞排列均较为整齐,且核仁固缩情况均有一定改善。4.Aβ1-42免疫组化积分光密度分析结果显示：与N组相比较,AD组小鼠海马区A β1-42蛋白的积分光密度明显升高(P0.01)。与AD组相比较,M组、A组、MA组、EA组及MEA组小鼠海马区A β 1-42蛋白的积分光密度均显著下降(M组：P0.05；A组、MA组、EA组及MEA组：P0.01)。与M组相比较,A组、MA组、EA组及MEA组小鼠海马区A β 1-42蛋白的积分光密度均显著下降(A组：P0.05；MA组、EA组及MEA组：P0.01)。与A组相比较,EA组与MEA组小鼠海马区Aβ 1-42蛋白的积分光密度均显著下降(EA组：P0.05；MEA组：P0.01)。5. NLRP3炎性小体相关蛋白(NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β)免疫组化与Western blot分析结果显示：NLRP3相对表达量：与N组相比较,AD组NLRP3蛋白的相对表达量明显增高(P0.01)。同样,M组、A组、MA组、EA组及MEA组小鼠海马区内的NLRP3蛋白相对表达量也较N组有所增加(P0.05)。同AD组相比较,M组、A组、MA组、EA组及MEA组小鼠海马区内的NLRP3蛋白相对表达量明显下降(P0.01)。ASC相对表达量：与N组相比较,AD组的ASC蛋白的相对表达量明显增高(P0.01)。与AD组相比较,M组、A组、MA组、EA组与MEA组小鼠海马区ASC蛋白相对表达量明显下降(P0.01)。Caspase-1相对表达量：与N组相比较,AD组小鼠海马区Caspase-1蛋白的相对表达量明显增高(P0.01)。与AD组相比较,M组、A组、MA组、EA组与MEA组小鼠海马区Caspase-1蛋白的相对表达量明显降低(P0.01)。IL-1β相对表达量：与N组相比较,其他各组小鼠海马区IL-1β蛋白的表达均显著增高(AD组、M组、A组、MA组与EA组P0.01；MEA组P0.05)。与AD组相比较,M组、A组、MA组、EA组及MEA组小鼠海马区IL-1β蛋白的表达均显著下降(P0.01)。与M组相比较,EA组与MEA组海马区IL-1β蛋白的表达较M组有所下降(P0.05)。结论1.针刺干预方法可改善老年痴呆模型小鼠的空间学习记忆能力,针药联合干预的改善效果优于单一药物(多奈哌齐)干预；脉冲电针与音乐电针的干预效果均优于药物干预,且音乐电针的优势作用更为明显。2.针刺干预方法可改善老年痴呆模型小鼠海马区神经元葡萄糖代谢水平,针药联合干预的改善效果优于单一药物(多奈哌齐)干预；脉冲电针与音乐电针的干预效果均优于药物干预,且音乐电针的优势作用更为明显。3.针刺干预方法可改善老年痴呆模型小鼠海马齿状回神经元的凋亡现象,并能有效抑制A β1-42的表达且作用效果优于药物多奈哌齐,针药联合干预对此的改善效果可明显优于单一药物(多奈哌齐)干预；脉冲电针与音乐电针对A β1-42的抑制作用既优于药物多奈哌齐,又优于单一针刺干预,且音乐电针的优势作用更为明显。4.针刺干预方法可有效抑制老年痴呆模型小鼠海马区炎性因子IL-1β的表达,针药联合干预的抑制效果优于单一针刺干预；脉冲电针与音乐电针的干预效果均优于药物干预,且音乐电针的优势作用更为明显。5.“通督启神”针刺干预方法可有效抑制小胶质细胞内Aβ蛋白内源性受体NLRP3炎性小体相关蛋白：NLRP3、ASC与Caspase-1的合成与表达,从而降低炎性因子IL-1β的分泌与释放。
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【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R245;R-332
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本文编号：2366794