基于阿霉素致心肌损伤模型发现丹参药效成分及作用机制

发布时间：2018-12-12 14:16

【摘要】：随着癌症化学治疗药物的效果不断提高,癌症患者的预后也随之不断改善。然而,由于化疗引起的心肌病变却成为癌症患者不良预后的重要因素之一。阿霉素(多柔比星,Doxrubicin)属于蒽环类药物,是目前临床常用的癌症化疗药物。然而,阿霉素的使用会造成不可逆性的心肌损伤,最终导致心力衰竭。关于阿霉素致心肌损伤的确切机制相对复杂,近期研究认为,线粒体损伤、氧化应激、钙超载和细胞遗传毒性是阿霉素造成心肌损伤的主要机制。心肌损伤的发展过程是动态的,具有时间相关性。时序性基因表达分析为研究生命过程提供了时间维度的丰富信息,其中不仅包括静态基因表达结果,还能够表现基因表达的动态关系。因此,通过时序性基因表达分析,更全面的构建疾病进展的生物网络,表述致病机制,为药物研发和临床治疗提供指导。本研究采用丹参作为研究载体,研究丹参中保护心肌抵抗阿霉素损伤的有效部位和成分及其作用机制,主要内容包括以下四个方面:1、阿霉素损伤大鼠心肌时序性基因表达分析本文采用DrugMatrix数据库内阿霉素作用大鼠心肌实验转录组芯片结果,通过GC稳健多芯片平均化(GCRobust Multi-array Average,GCRMA)方法进行芯片背景校正,获得转录组数据结果。以观测时间点正常组作为对照,获得阿霉素作用1天、3天和5天的差异化表达基因,筛选阈值为1.5倍表达倍率,p值小于0.05,三个时间点差异化表达基因共计815个。进一步,采用短时序表达数据挖掘(Short Time-series Expression Miner,STEM)工具包进行时间相关的基因表达模式分析,共呈现9种表达模式,对每类基因表达模式进行GO功能富集分析,取各组别中主要作用基因共计196个;采用STRING数据库搜索蛋白-蛋白相互作用,共计563个作用节点,构建阿霉素损伤大鼠心肌作用机制动态生物网络,为接下来分析中药活性成分作用机制提供了理论基础。2、阿霉素损伤大鼠H9C2心肌细胞模型建立基于第一部分阿霉素损伤机制分析,通过高内涵实时细胞荧光技术建立阿霉素损伤大鼠H9C2心肌细胞模型,获得多种与细胞健康程度相关参数,包括线粒体损伤、钙离子超载和遗传毒性,从多方面同时表现阿霉素造模情况。选取自由基清除剂依达拉奉作为阳性化合物,通过H9C2细胞评价了依达拉奉的心肌毒性量效关系,同时评价了依达拉奉保护H9C2细胞抵抗阿霉素作用的量效关系。结果发现,10 μ依达拉奉能够抑制阿霉素引起的细胞凋亡和钙超载现象,但对阿霉素引起的遗传毒性无明显作用。为进一步对丹参有效部分和成分发现奠定了实验基础。3、丹参馏分制备及成分含量测定本文以丹参为研究载体,建立了高效液相色谱外标法测定丹参种14种成分,包括丹参素、原儿茶醛、阿魏酸、金合欢素、丹酚酸D、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、鼠尾草酚、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮ⅡA、齐墩果酸含量方法,并经过方法学考察。比较了甲醇提取和20%甲醇-水提取方法,结果表示,甲醇能够充分获得丹参成分。通过液相色谱转换方法,将分析液相方法转换至微量制备液相,结合丹参提取物含量测定结果,制备丹参醇提物馏分。对获得的6个丹参馏分进行含量测定,以丹酚酸B作为指标成分,折算后得到丹酚酸B摩尔浓度为4.02 mmol/L,可用于进一步馏分活性验证实验。4、丹参馏分及中药小分子活性筛选及作用机制解析采用H9C2细胞验证6个馏分的细胞毒性作用,并采用阿霉素损伤大鼠H9C2心肌细胞模型评价各个馏分保护作用,发现馏分1和馏分2具有一定的心肌保护活性。选取课题组中药小分子化合物库中常见中药成分76个与丹参中14种指标成分组成备选化合物,采用阿霉素损伤大鼠H9C2心肌细胞模型进行高通量筛选,对获得的6个细胞活性相关参数采用主成分-K均值分类模式识别,共获得8种作用模式,其中丹参中单体化合物与依达拉奉有相似作用的有丹参素、原儿茶醛、阿魏酸、金合欢素、丹酚酸A、二氢丹参酮。活性成分单体主要分布于馏分1和馏分2中,与馏分活性结果相符。进一步分析单体作用机制,基于课题组前期对丹参中小分子化合物药效靶点预测和数据库整理,提取活性丹参小分子靶点,与第一部分生物网络中蛋白匹配,发现主要作用靶点为MMP2、ALOX15、APP、CYP2E1,对主要作用靶点和动态生物网络中一级节点基因进行功能富集分析,发现丹参发挥保护心肌作用成分来自极性较大部位,主要机制是通过抑制凋亡过程,减轻缺氧反应。本文以丹参为研究载体,基于时序性基因表达分析结果和细胞学验证实验,从单体-馏分层面探讨并验证了丹参保护心肌抑制阿霉素损伤的有效部位和作用机制,为从分子层次和系统层面上揭示中药复杂成分体系作用机理提供方法学支持。
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【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5;R-332

【参考文献】