G72蛋白表达及调控氧化应激的分子制研究

发布时间：2018-12-12 20:58

【摘要】：G72是具有153个氨基酸的灵长类特有蛋白质,多项研究指出G72具有与DAO (D-amino acid oxidase)交互作用的特性,而且这些交互作用与精神分裂症、重郁症及其他精神疾病具有高度相关。DAO是一代谢D型氨基酸的酶,需要黄素做为其辅基,主要功能在于调控突触间神经传递物质D-serine的浓度。D-serine 为N-methyl-D-aspartate (NMDA)受体的配体,NMDA受体的过活或低活可能与神经或精神疾病的发生相关。因此本论文将证明G72可能经由抑制DAO的酶活性,进而调节突触间D-serine的浓度。在此研究中,我们分别制备了pMAL-C2G-DAO、 pGEX-6p-1-G72、pET23a-DAO及pET23a-G72蛋白质表达质粒。初步的活性测试发现MBP tag的体积太大,严重的影响了DAO的活性,而GST-G72蛋白有断裂现象,因此我们以DAO-6H及重新折迭(re-folding)后的G72-6H为本论文的主要探讨对象。为了探讨G72第30个氨基酸突变后的活性,本实验以单点突变技术将G72的第30个氨基酸Arginine突变为带正电的Lysine、带负电的Glutamate以及不带电的Alanine。接着,我们探讨G72-6H和G72R30A-6H、G72R30D-6H及G72R30K-6H与调控DAO活性的差异,我们利用D-proline为受质,以不同DAO:G72之浓度比测试加入各种G72-6H后DAO的活性变化。我们的实验结果显示随着G72-6H浓度比例的增加,G72-6H显著的抑制DAO活性。G72R30A-6H、G72R30K-6H在1：16的比例下亦可抑制22.14%和13.18%的DAO活性,而G72R30D-6H却无显著的抑制现象。本研究体外实验证据证明了G72的第30个氨基酸可能扮演与DAO结合的角色并经由交互作用抑制DAO的酶活性。此机制可使脑中神经传导物质D-serine的浓度降低。这个结果也许可以说明部分研究报告所指出的G72R30K(rs2391191)于精神疾病中占有较高的比例。进一步利用基因芯片技术进行筛查,寻找G72过表达引起的氧化应激改变。基因芯片技术筛查获得了有意义的阳性结果,说明G72对氧化应激具有影响作用。G72转染细胞与对照组之间的差异,主要表现为抗氧化应激基因表达上调。这种抗氧化基因表达上调有可能是G72转染细胞对增高的ROS水平的一种适应性代偿。本研究发现G72蛋白会与野生型正常的SOD1蛋白发生结合,在神经胶质瘤U87细胞株中过表达G72蛋白会诱导产生ROS,进一步证实G72参与氧化应激调控。神经胶质瘤U87细胞株中过表达G72蛋白会诱导HADHB(线粒体膜蛋白)、P21、P53、STAT1、AMPKr-1、Cytochrom C、P38α、MAPK的表达量都上升,提示过表达G72蛋白可能会通过细胞自噬、细胞周期停滞、和细胞凋亡三种路径通路伤害细胞；将G72基因转入ALS模式小鼠(SOD1_G93A)大脑运动皮质区,发现小鼠运动能力下降、寿命缩短,提示G72蛋白可能会破坏小鼠的神经细胞造成运动能力下降。本研究以SOD类似物Tempol处理G72转染细胞,以改善细胞的氧化应激状态,结果抗氧化剂的应用有效降低了G72转染细胞的ROS水平,这一结果表明氧化应激是G72转染细胞发生的关键效应,G72通过诱发ROS,促进氧化应激的发生。有研究表明G72载体转染动物后,ROS升高是由于过表达G72诱发了氧化应激,从而说明G72很可能是诱发氧化应激的重要原因。因此,我们对G72转染细胞的氧化应激改变进行了验证。首先对G72转染细胞评价其ROS水平,发现ROS在G72转染细胞中升高明显,提示存在氧化应激状态改变。我们还从细胞清除ROS能力的角度出发,进一步分析了抗氧化酶SOD1的活力,G72转染细胞SOD活力比空载体转染细胞有所下降。上述结果表明,G72转染细胞处于氧化应激状态,遭受氧化应激损伤,并且抗氧化能力受到一定程度损伤。综上所述,过表达的G72会与细胞质中SOD1蛋白形成复合物,导致SOD1堆积于线粒体,由于SOD1堆积致使蛋白活性下降,无法有效清除超氧化物,使氧化应激增高,最终导致神经细胞伤害或死亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R3416

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本文编号：2375238