芍药苷对鱼藤酮致帕金森模型神经损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2019-01-28 13:41

【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是较常见的神经系统退行性疾病,目前没有很好的药物治疗。近年来,中药及其中药单体成分对PD的治疗或辅助治疗越来越受到人们的关注。芍药苷(paeoniflorin,PF)为中药芍药的主要有效单体成分,具有神经保护作用。本课题旨在探讨PF对鱼藤酮致PD模型损伤的保护作用及机制,期望为PD的治疗提供新的思路和方法。本实验首先利用鱼藤酮作用于C57BL/6小鼠致PD体内模型,评价PF是否具有神经保护作用。如果小鼠体内实验具有神经保护作用,则利用鱼藤酮作用于SH-SY5Y细胞株致PD体外模型,进行PF神经保护作用机制的研究。利用C57BL/6小鼠进行体内实验。雄性C57BL/6健康小鼠43只,体重20±2 g。动物适应性饲养观察一周后,称重。先随机分为3组:正常组(n=6)、溶剂组(含2%DMSO的橄榄油溶液)(n=7)和模型组(鱼藤酮橄榄油溶液)(n=30)。利用鱼藤酮接触式给药致C57BL/6小鼠PD模型。在造模第31天、32天、33天、34天、35天、36天和40天时,进行转棒实验,初步评价模型是否成功。接触式给药40天后,剔除造模不成功的动物4只。将造模成功的动物26只,再随机分为3组:模型组(给予鱼藤酮7.5 mg/kg)(n=9)、阳性药物组(给予7.5 mg/kg鱼藤酮和120 mg/kg美多芭)(n=8)和PF治疗组(给予7.5 mg/kg鱼藤酮和5 mg/kg PF)(n=9)。第41~49天,鱼藤酮处理3 h后,动物灌胃给药,一天一次。正常组、溶剂组、模型组灌胃无菌水,阳性药物组和PF治疗组分别灌胃给于美多芭和PF溶液。每日一次,持续给药9天。采用转棒实验观察药物干预前后小鼠行为学的变化,以小鼠在转棒上停留的时间表征小鼠的平衡能力,并对小鼠平衡能力进行评分。行为学检测后,每组随机选取3只小鼠,用5%的水合氯醛麻醉小鼠,迅速打开胸腔,经左心室灌注生理盐水,待肝组织变白后改用4%的多聚甲醛灌注固定,完毕后迅速取出脑组织,用4%的多聚甲醛固定24h以上,从固定液中取出脑组织,进行酒精梯度脱水(50%乙醇40min,70%乙醇40 min,90%乙醇25 min,100%乙醇15 min,100%乙醇15 min),透明(二甲苯Ⅰ15 min,二甲苯Ⅱ15 min),浸蜡90 min,包埋,脑组织冠状切片,5μm厚度,进行HE染色。利用鱼藤酮诱导SH-SY5Y损伤模型作为PD研究的体外模型,待细胞贴壁生长汇合度达到70-80%时,消化分组。实验分为正常组、0.0125%DMSO溶剂组、鱼藤酮模型组、鱼藤酮和美多芭同时给药组、鱼藤酮加PF组(PF设置三个浓度组)。鱼藤酮终浓度为0.25μmol·L-1,美多芭的终浓度为15μmol·L-1(以左旋多巴计),PF的终浓度分别为0.08μmol·L-1、0.4μmol·L-1、2μmol·L-1,药物作用于细胞24 h后,采用MTT法检测细胞活力,采用微量酶标法测定上清液中的乳酸脱氢酶的活力,采用倒置显微镜观察细胞形态,Western Blot检测细胞中α-synuclein的表达情况,HE染色检测Lewy的形成。体内动物实验中,溶剂组和正常组相比,小鼠在转棒上停留时间无显著性差异;模型组与溶剂组相比,在转棒上停留时间明显缩短(P0.05);阳性药物组和PF治疗组与模型组相比,在转棒上停留时间明显延长。HE染色后,正常和溶剂组炓质致密部(substantia nigra compact,SNC)细胞核清晰,神经元形态完整,排列整齐,核仁明显。模型组与溶剂组相比,神经元数目减少,核仁不明显,胞浆浓染。给予美多芭和芍药苷以后,可以逆转上述变化。在体外细胞实验中,溶剂组和正常组相比,细胞活力没有显著性差异(P0.05),LDH活力也没有明显差异(P0.05);模型组和溶剂组相比,细胞活力下降(P0.05)、LDH活力明显升高(P0.05)、细胞突触变短,细胞变圆、细胞数量减少,Lewy明显增多(p0.05),α-synuclein表达量明显增多。加入美多芭和PF以后,可以逆转上述变化。综上所述,PF对鱼藤酮致帕金森模型具有神经保护作用,减少Lewy的形成和降低α-synuclein的表达有关。
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【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5;R-332

【参考文献】