结核杆菌耐热抗原对人肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌SP-B和凋亡的影响

发布时间：2019-02-17 16:54

【摘要】：背景及目的:现有对于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)的研究主要是通过M.tb的自身成分或其分泌成分刺激诱导不同免疫细胞(DC细胞、γδT细胞等)来研究其相关作用机制,但对于抵御M.tb入侵肺部过程中发挥重要作用的肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell,AT2)的研究还鲜见报道。已知临床上广泛使用的结核病(tuberculosis,TB)疫苗-卡介苗(Bacille-Calmette-Guerin,BCG)存在着对成人肺结核保护不稳定的不足,因此新靶向药物的研发也成为TB治疗的新研究课题。本实验研究从M.tb入侵人体肺部的重要屏障——AT2细胞为切入点,选用与AT2细胞具有相同表型和特征的人肺腺癌细胞系(human lung adenocarcinoma cell line,A549)细胞,通过结核杆菌耐热抗原(Mycobacterium tuberculosis heat-resistant antigen,Mtb-HAg)刺激诱导A549细胞,探讨对A549细胞分泌肺泡表面活性物质相关蛋白B(pulmonary surfactant-associated protein B,SP-B)的作用和对其凋亡的影响。进而间接研究Mtb-HAg对AT2细胞分泌SP-B和凋亡的作用,为较好的研究肺部感染TB早期AT2细胞抵御M.tb入侵的机制提供新的理论依据;同时初步探究Mtb-HAg对AT2细胞的凋亡作用,为进一步深入研究其作用通路提供新的思路。方法:(1)用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%双抗的杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Media,DMEM)培养基,在37℃5%CO2恒温培养箱中培养A549细胞;用DMEM培养基稀释成不同浓度的Mtb-HAg工作液,分别刺激诱导A549细胞培养24 h,48 h,同时设置对照组。(2)采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法分别检测空白对照组1、阳性对照组(脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激诱导培养24 h)和实验组1(不同浓度的Mtb-HAg分别刺激诱导培养24 h,48 h)的培养上清中SP-B的表达量。(3)使用实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,q RT-PCR)法分别检测空白对照组1、阳性对照组(LPS刺激诱导培养24 h)和实验组1(不同浓度的Mtb-HAg分别刺激诱导培养24 h,48 h)中目的基因SFTPB的相对表达量变化。(4)运用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)分别检测空白对照组2、阳性对照组(姜黄素刺激诱导培养24 h)和实验组2(不同浓度的Mtb-HAg分别刺激诱导培养24 h)的细胞凋亡率变化。结果:(1)与空白对照组1相比,诱导培养相同时间,阳性对照组(LPS组)和实验组1(不同浓度Mtb-HAg刺激诱导培养相同时间)的SP-B表达量显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);实验组1(相同浓度Mtb-HAg刺激诱导培养不同时间)的SP-B表达量降低不明显(P0.05)。(2)相同培养时间,实验组1(不同浓度的Mtb-HAg刺激诱导培养)和阳性对照组(LPS组)中基因SFTPB的相对表达量均低于空白对照组1,差异具有统计学意义(P0.05);而在相同的Mtb-HAg优势刺激诱导浓度下,实验组1基因SFTPB的相对表达量随时间变化不显著,差异无统计学意义(P0.05)。(3)阳性对照组(姜黄素组)的A549细胞凋亡率高于空白对照组2,差异具有统计学意义(P0.05);实验组2中A549细胞的凋亡率均与空白对照组2相比,均显著升高,差异具有统计学意义(P0.05);但实验组2之间A549细胞的凋亡率变化不显著(P0.05)。结论:(1)Mtb-HAg对AT2细胞的体外模型A549细胞的SP-B分泌和其表达SP-B的基因SFTPB的表达具有抑制作用,从而有利于更好的研究AT2细胞在M.tb侵入人体肺部初期时发挥作用的机制。(2)Mtb-HAg可以诱导A549细胞发生凋亡,为M.tb的Mtb-HAg对于人AT2细胞的凋亡作用机制研究提供新的途径。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378.911

【参考文献】