内源性小分子二甲基硫醚对氧化应激损伤的作用及机制研究

发布时间：2019-03-19 21:49

【摘要】：第一部分小分子二甲基硫醚对氧化应激损伤的作用 目的：二甲基硫醚(dimethyl sulfide, DMS)是一种易挥发硫化物,也是大气中最主要的含硫物质。其在人类的血液、尿液、口气甚至是皮肤组织中都存在,但有关于DMS在高等动物中的功能却鲜有报道。本部分旨在研究DMS在高等动物体内对氧化应激损伤的保护作用及对寿命的调控作用。 方法：顶空固相微量萃取法气象色谱-质谱联用、活性氧荧光探针、超氧化物荧光测定、脂质过氧化物测定、细胞存活率测定、电子自旋波谱测定和模式动物寿命实验 结果：(1)DMS在大鼠的多个重要组织中均存在,线虫、果蝇等体内也存在DMS,其含量低于大鼠组织；在衰老大鼠的脑和心脏组织中DMS含量显著下降；(2)在大鼠脑组织匀浆和心脏组织匀浆中,生理浓度的DMS(1μM)显著降低过氧化氢诱导的脂质过氧化程度,其标记物丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著下降；(3)生理浓度的DMS (0.2μM,1μM和5μM)显著抑制PC12细胞中抗霉素A(antimycinA, AA)诱导的活性氧簇生成；(4)DMS (5μM)显著抑制AA诱导的超氧化物生成；使用电子自旋波谱技术测定AA诱导的羟基自由基,发现DMS (5μM)显著降低AA诱导的羟基自由基生成；(5)培养基中加入DMS能够延长线虫和果蝇的寿命；含10μM DMS的培养基组,线虫由衰老引起的超氧化物蓄积显著降低：以100μM DMS处理能降低果蝇由衰老引起的脂质过氧化物堆积。 结论：DMS是存在于高等动物组织中的一种内源性抗氧化物,具有减少细胞的氧化应激损伤和延长动物寿命的作用,可能在内源性抗氧化防御体系中扮演了重要角色。 第二部分小分子二甲基硫醚抗氧化应激损伤的机制 目的：蛋氨酸亚砜还原酶A (methionine sulfoxide reductase, MsrA)是蛋氨酸亚砜还原酶家族的重要成员之一,由于其在体内氧化还原过程中的作用受到了广泛关注。MsrA广泛表达于从低等到高等的大多数物种的各种组织中,可以修复发生氧化损伤的蛋白,对包括神经元在内的多种细胞具保护作用。近年来有研究表明MsrA不仅可修复蛋白质损伤,还可直接增强细胞对活性氧的清除,减缓细胞的氧化应激水平。本实验室的前期研究发现,L-蛋氨酸可能是MsrA发挥抗氧化作用的重要底物。目前,尚无报道发现其他内源性小分子作为底物参与MsrA催化的抗氧化体系。本部分从MsrA催化抗氧化体系的化学生物学机制出发,探讨内源性DMS发挥抗氧化作用的分子机制。 方法：鲁米诺化学发光、电子自旋共振波谱、腺病毒表达-shRNA表达干扰、构建蛋白表达质粒、表达纯化融合蛋白、Western Blotting免疫印迹、液相色谱-质谱联用、荧光各向异性测定、计算机构建蛋白结构模型、计算机模拟蛋白-底物相互作用、定点突变、顶空固相微量萃取法气象色谱-质谱联用 结果：(1)体外实验表明：DMS本身具有抗氧化性,高浓度时(1mM和10mM)能剂量依赖性地减少试管反应中的过氧化氢含量,但低浓度DMS (0.1mM)的抗氧化作用较弱：在Fenton反应体系中,高浓度的DMS (1mM)能直接减少羟基自由基的含量,但低浓度DMS (0.1mM)不能降低体系中羟基自由基；(2)体外实验表明：MsrA可直接催化低浓度的DMS和过氧化氢、羟基自由基等发生反应,在MsrA催化下,0.1mM DMS清除过氧化氢和羟基自由基的能力显著增强；(3)使用慢病毒介导的小发卡RNA (small harpin RNA, shRNA)技术下调PC12细胞中MsrA的表达,能取消DMS的抗氧化应激、保护细胞的作用。和对照shRNA病毒组相比,对照病毒组中的DMS能显著降低AA诱导的超氧化物荧光,而MsrA shRNA病毒组中,DMS不能降低超氧化物的荧光值。对照病毒组中,DMS能显著降低过氧化氢诱导的PC12细胞死亡；MsrA shRNA病毒组,DMS不能降低MDA水平;(4)DMS对果蝇寿命的延长作用依赖于果蝇的MsrA,使用UAS-GAL4系统抑制果蝇MsrA的转录后,DMS延长果蝇寿命的作用被取消；(5)荧光各向异性实验验证,DMS与MsrA可发生直接的相互作用；气质联用技术又进一步发现MsrA会把DMS转化成二甲基亚砜(DMSO);通过生物信息学和计算化学建立MsrA的空间结构模型,分析MsrA催化抗氧化的化学生物学机制,模拟各种小分子底物和MsrA的结合方式,证明DMS是MsrA的优势底物,并推测出介导催化反应的关键氨基酸残基位点包括：72位半胱氨酸残基,103位酪氨酸,115谷氨酸残基,即C72,Y103,E115；(6)定点突变催化反应的关键氨基酸残基后,MsrA对活性氧的催化反应活性明显下降。 结论：内源性DMS是MsrA催化抗氧化体系的重要小分子底物,在氧化应激条件下,通过和MsrA的72位半胱氨酸残基,103位酪氨酸,115谷氨酸残基等关键残基形成中间体,快速和活性氧反应生成DMSO,从而发挥其抗氧化作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411

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本文编号：2443938