白念珠菌Ofi1及铁离子渗透酶的功能研究

发布时间：2019-04-10 15:28

【摘要】：白念珠菌(Candida albicans)是一种常见的人体病原真菌,存在于大部分正常人的口腔、上呼吸道、肠道及阴道等黏膜组织和脏器中,是一种机会性致病真菌。通常情况下白念珠菌不会引起人体疾病,当机体免疫功能或一般防御力下降、以及宿主体内正常菌群相互制约作用失衡时,则会引起念珠菌病。近年来,随着现代医学技术(如免疫抑制和器官移植等)的广泛应用,白念珠菌感染的比例呈现出明显增长的趋势。白念珠菌能够成为人体内成功的条件性致病真菌的一个重要原因是它具有形态可塑性(phenotypic plasticity)这样一个显著特征。这种形态可塑性体现在白念珠菌能够以不同形态存在,比如,酵母形态、菌丝形态、white和opaque形态等。在一定的条件下,白念珠菌可以在不同的形态之间相互转换,以更好的适应环境的变化。最为典型的两种形态转变系统为酵母(Yeast)-菌丝(Filaments)、white-opaque之间的相互转换。白念珠菌形态转变是一个非常复杂的过程,这种形态转换与白念珠菌的致病性是直接相关的。因此,深入研究白念珠菌形态转换分子机理将有助于更好的认识其致病机理,有助于未来对念珠菌病的治疗提供新的思路。本研究以揭示白念珠菌形态转换的分子调控机理为目的,对锌指结构转录因子Off1以及高亲和性铁离子渗透酶Ftr1和Ftr2在白念珠菌形态转换过程中的调控作用进行研究。主要研究结果如下：1.OFI1基因的分子特征及其表达谱分析白念珠菌的基因orf 19.4972 (GeneBank accession:68467498)是一个功能未知基因,我们将之命名为OFI1 (opaque and filamentation inducer 1)。其ORF框编码含有648个氨基酸残基的蛋白,其分子量为71262 Da,等电点为9.41。通过对氨基酸序列分析发现,Ofil蛋白含有3个串联的C2H2型锌指结构基序(ZnF_ C2H2, aa97-119, aa 125-147, and aa 153-173),表明Off1具有结合DNA的能力。通过对多个包括microarray和RNAseq在内的高通量数据分析发现,orf9.4972在白念珠菌opaque细胞中的转录水平均高于white细胞。利用RT-qPCR进行验证,结果显示opaque田胞中OFI1的表达水平是white细胞中OFI1表达水平的近120倍。2.Ofil在白念珠菌white-opaque形态转换中的功能通过将OFI1基因置于ACT1启动子下进而构建了过表达质粒,将质粒线性化后转入白念珠菌野生型菌株WUM5A中构建了OFI1过表达菌株,并通过RT-qPCR验证了过表达菌株中OFI1的表达水平显著性的高于对照菌株的相同形态细胞中的表达水平。随之,进行了white-opaque转换频率实验,结果显示,在野生型细胞中过表达OFI1后,在Lee's Glucose以及Lee's GlcNAc培养基上进行培养后,白念珠菌opaque形成的比例都显著性地增强,也就是white向opaque转换的频率增加了,尤其是在Lee's GlcANc培养基上,OFI1过表达使得白念珠菌几乎100%地由white细胞变为opaque形态的细胞。但是opaque向white转换的频率却没有因为OFI1的过表达而受到显著的影响,暗示OFI1的过表达对于将细胞维持在opaque状态的作用并不大。关键基因WOR1的敲除使得白念珠菌很难由white向opaque形态转换,细胞被锁定在white状态。为了进一步确定OFI1与WORl的关系,我们在WOR1缺失株中过表了OFI1基因,white-opaque转换实验结果显示,在缺失关键调控因子Wor1的情况下,OFI1的过表达并不能恢复细胞由white向opaque形态转换的能力。因此,Off1可能并不能单独行使对这种形态转换的调节功能,而是需要与其它受到Wor1调节的转录因子一起才能发挥作用。此外,还构建了OFI1基因的缺失株及其回补菌株,通过统计white-opaque形态转化频率发现,OFIl基因的缺失虽然不能够阻止white向opaque形态的转换,但是在Lee's GlcNAc培养基上,其缺失能够降低white向opaque的转换频率,这与OFI1基因过表达促进white向opaque转换的结果是一致的。但是,无论是过表达OFI1还是敲除OFI1,其对opaque形态的维持并不是那么重要,对opaque向white的转变频率没有显著性影响。综合这些结果,OFI1对white-opaque形态转换的调节功能虽然没有基因WOR1的功能强,但是它在整个white-opaque形态调节网络中占有自己的位置,与其它功能还未知的调控因子一起,影响着white-opaque的形态转换,对其进行微调的作用。3.Ofi1在白念珠菌菌丝生长和侵入性生长过程中的作用除了对Off1在white-opaque形态转换中的功能研究,我们还对Off1在白念珠菌菌丝生长过程中是否发挥作用进行了研究。同样的,在野生对照株CAI4中过表达了OFI1,并在不同的培养条件下进行菌丝生长实验。培养条件包括三种培养基(Lee's Glucose、Lee's GlcNAc和Spider)和三种温度条件(25℃、30℃和37。C)。低温25。C不宜于菌丝的生长。在25℃培养条件下,在Lee's Glucose培养基和Spider培养基上,OFI1的过表达显著性的促进了菌丝的生长。30℃培养条件下,在Lee's Glucose和Spider培养基上,OFI1的过表达能促进菌丝的生长,但由于GlcNAc是促进白念珠菌菌丝生长的重要环境因子,在Lee'GlcNAc培养基上,对照菌株的菌丝也呈现出大量的生长,很难比较过表达菌株与对照菌株的菌丝生长能力。高温37。C是白念珠菌容易进行菌丝生长的温度条件,在37。C培养条件下,所有培养基上的对照菌株均能进行大量的菌丝生长,难以区别对照菌株和OFI1过表达菌株菌丝生长能力的强弱。在WOR1基因突变体中过表达OFI1是不能促进white向opaque形态转换的,因此OFI1过表达对white-opaque形态转变的促进作用是依赖于WOR1的。OFI1过表达对菌丝生长的促进作用是否也是依赖于WOR1?基于这样的问题,我们对wor1-/-突变体中过表达了OFI1的菌株进行了菌丝生长能力实验。结果显示在Spider培养基上,不论是25℃培养还是30℃培养,wor1-/-突变株中过表达OFI1能够非常明显的促进菌丝的形成；Lee's Glucose培养基上,25℃培养条件下,在worl-/-突变体中过表达OFI1对菌丝生长的影响不大,但是30℃培养条件下,过表达菌株菌丝的生长能力强于对照菌株。而在Lee's GlcNAc培养基上过表达菌株和对照株的菌丝生长能力都很强。因此,过表达OFI1能够在一定的条件下促进菌丝生长,并且这种促进作用是不依赖于WOR1基因的表达。但是,通过对OFI1缺失菌株和回补株进行菌丝生长实验发现,在各个不同培养条件下,该基因的缺失对白念珠菌菌丝生长并不能产生显著性影响,因此OFI1基因并不是菌丝生长所必须的。白念珠菌侵入生长的能力被认为是感染宿主初期时穿透组织所需要的。菌丝的生长与其侵入生长能力是密切相关的。为了验证这一点,我们对过表达菌株的侵入生长能力进行了实验。结果显示在25℃培养条件下,OFI1过表达菌株的侵入生长能力显著性增强。但是在30℃和37℃度的条件下,所有菌株都能进行侵入生长,因此OFIl过表达对菌株侵入生长的影响在较低温度下更加显著。4.高亲和性铁离子渗透酶Ftrl和Ftr2调控白念珠菌生长和形态发生微量元素铁对于几乎所有生物的生长都是必须的。白色念珠不仅能生存于铁含量丰富的环境,比如人体肠道系统,还能生存于铁含量极低的环境,比如血液中。Ftr1和Ftr2是目前已知的白念珠菌中两种对铁离子具有高亲和性的渗透酶,分别编码381和382个氨基酸的蛋白。两者具有高达83%的同源性,含有多个跨膜区和铁离子结合区,但其生物学特性却并不相同。FTR1在铁含量受限的时候表达量升高,而在铁含量比较丰富的情况下其表达水平是被抑制的；FTR2的表达情况正好相反。在低铁环境中,仅Ftr1行使高亲和性铁摄取活性,并对白念珠菌的生长产生影响,此外,Ftrl对于白念珠菌感染宿主并产生毒性非常关键,该基因的缺失使得菌株不能有效地对宿主产生感染。而Ftr2对白念珠的生理活动及毒理效应并不清楚。环境中铁的丰度对白念珠菌菌丝生长、肠道中共生及致病能力都有一定的影响。但是,目前对高亲和性铁离子渗透酶在白念珠菌菌丝生长中的功能还没有进行过系统的研究。Ftrl和Ftr2与菌丝生长是否存在相关性,并未可知。我们对FTR1、FTR2基因缺失株在不同培养条件下的生长情况以及菌丝生长能力进行分析,明确了高亲和性铁离子渗透酶在白念珠菌生长和形态发生中的功能。通过将不同基因型的菌株分别置于不同的培养基和培养温度下进行培养,对其生长速度以及菌丝的生长状态进行观察。结果显示,在所有测试过的培养条件下,FTR1或FTR2单基因缺失对于白念珠菌的生长没有显著的影响,但是FTR1、FTR2双基因缺失使白念珠菌在Spider培养基中不能生长,铁离子的添加能够恢复该双基因缺失株的生长能力；FTR1、FTR2双基因缺失株在营养贫瘠的合成培养基上生长速度也较慢；ftr1/frt1菌株的菌丝生长能力增强,而ftr2/ftr2菌株的菌丝生长能力减弱。双基因突变株ftr1/ftr1 ftr2/ftr2的菌丝生长能力能够恢复到野生对照株的水平。这些结果提示Ftrl对白念珠菌菌丝生长起负调控作用,Ftr2对菌丝生长起正调控作用。同时,Ftrl与Ftr2不仅对白念珠菌在微量铁元素环境中的生存有着重要的作用,还参与了白念珠菌对碳源N-乙酰葡萄糖胺、乙醇和甘油等的利用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R379.4

【共引文献】