氧化应激通过亲环蛋白A促进人巨细胞病毒复制的研究

发布时间：2019-04-09 17:17

【摘要】：人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是巨细胞包涵体病的病原体。HCMV在自然界普遍存在,属于β疱疹病毒属,具有严格的种属特异性,人是该病毒的唯一宿主。该病毒复制周期长,尤其是在细胞培养中病毒复制非常缓慢。HCMV具有208个开放读码框架,能编码200余种多肽,这使该病毒致病机理和宿主关系的研究复杂困难。HCMV可在感染者体内长期潜伏存在,能通过垂直或者水平传播,感染病毒后常无明显的临床症状表现。当机体免疫功能低下时,HCMV则从潜伏状态进入活化状态并大量复制,进而出现间质性肺炎、不典型淋巴细胞增多、视网膜炎、肝炎、结肠炎和脑膜脑炎等,可导致严重的移植物排斥和多器官衰竭,甚至死亡。关于HCMV活化复制的假说包括:缺血/缺氧假说、器官移植假说、辐射损伤假说、炎症因子假说等。这些研究都是在特定条件下研究某个因素对HCMV的影响,并不能从根本上阐释HCMV活化复制的机制。目前针对HCMV感染,多采用更昔洛韦、缬更昔洛韦、膦甲酸和昔多呋韦等,但临床上仍不能有效控制HCMV导致的不良结局,且长时间使用这类药物会使患者出现严重的毒副反应,也会加速HCMV耐药株的产生。因此,探索HCMV复制及其相关生理过程对防控HCMV感染至关重要。研究发现,受HCMV侵害人群中的一个共同特点是氧化还原稳态失衡而表现出高水平的氧化应激状态。与此同时,细胞在氧化应激形成过程中亲环蛋白A(cyclophilin A,CyPA)的表达也随之增强,该过程也可同时激活p38-MAPK信号通路,促进下游转录因子的表达。p38-MAPK信号通路激活的转录因子可能与HCMV立即早期启动子/增强子(major immediate early promoter/enhancer,MIEP)区域结合,进而促进下游HCMV基因的转录。然而,氧化应激通过CyPA激活p38-MAPK信号通路以及其对HCMV复制的影响尚不明确。因此,我们期望通过细胞内、外过氧化氢刺激诱导细胞形成氧化应激,并在此基础上,观察氧化应激及抗氧化剂对病毒复制的影响,明确氧化应激与病毒复制之间的关系;通过分析在氧化应激条件下CyPA的基因和蛋白表达,进一步探索CyPA在氧化应激促进病毒复制过程中的作用,明确CyPA与氧化应激和病毒复制的关系;与此同时,探索过氧化氢刺激对p38-MAPK信号通路的影响,并明确该通路与HCMV复制之间的关系,为研究宿主与病毒复制之间关系和防治HCMV感染提供新的思路和方向。具体研究内容及结果如下:一、细胞氧化应激模型建立。通过细胞外给予过氧化氢和细胞内抑制过氧化氢酶活性的方式,提升细胞内过氧化氢促进细胞氧化应激形成。经ata处理后,细胞内过氧化氢酶活性受到抑制,细胞内过氧化氢浓度也随之升高;检测细胞内氧化应激水平,发现氧化应激水平随过氧化氢浓度增加而升高;western-blot检测抗氧化相关因子nrf2随过氧化氢浓度增加而发生核移位,证实细胞内、外过氧化氢可促进氧化应激的形成。二、氧化应激对hcmv在体外和体内复制的影响在氧化应激细胞模型基础上,一方面观察细胞外过氧化氢对hcmv复制的影响,另一方面抑制细胞内过氧化氢酶观察细胞内过氧化氢对hcmv复制的影响,进而明确氧化应激与hcmv复制之间的关系。双荧光素酶活性检测结果显示,过氧化氢能促进hcmvmiep的活性,并具有剂量效应关系;通过qrt-pcr检测病毒ie基因表达,western-blot检测pp72和pp65蛋白的表达,定量pcr检测培养上清中病毒颗粒以及病毒滴度均说明氧化应激能够促进hcmv在细胞中的复制。在此基础上,运用nac抑制细胞氧化应激形成,观察抗氧化对hcmv复制的影响。结果显示,采用抗氧化剂干预后细胞氧化应激水平受到抑制,也抑制了过氧化氢增强的miep的活性,继而影响ie基因、pp72和pp65蛋白的表达以及病毒的滴度;在体内实验中,nac也能抑制鼠巨细胞病毒(murinecytomegalovirus,mcmv)感染时mcmv在血液中的载量以及唾液腺及肺组织中的病毒滴度,这些结果印证了抗氧化剂能抑制由过氧化氢增强的hcmv复制增强。因此,上述结果说明了氧化应激同hcmv复制之间的关系,但宿主细胞调控hcmv复制的机制尚需进一步探索。三、cypa对氧化应激促进hcmv复制增强的影响在氧化应激促进hcmv的复制过程中,在基因和蛋白水平也观察到氧化应激增强了宿主细胞cypa的表达。当氧化应激水平受到抑制时,cypa表达也随之下降,说明cypa表达受氧化应激的调控,提示宿主细胞的cypa可能参与了hcmv的复制;为研究cypa与病毒复制之间的关系,通过慢病毒感染并筛选稳定表达干扰cypa的细胞株;给予稳定干扰cypa细胞过氧化氢刺激,发现氧化应激不能再增强hcmvmiep的活性,同时病毒的ie基因表达,蛋白表达以及病毒颗粒产生也均受到抑制;采用环孢菌素a(cyclosporinea,csa)抑制cypa的酶活性,在未改变细胞氧化应激水平和cypa水平的条件下,csa通过抑制cypa的酶活性抑制了过氧化氢增强的miep活性以及病毒ie基因和蛋白表达;在体内实验中,给予csa抑制了mcmv急性感染时病毒在血液中的载量以及唾液腺和肺组织中病毒的滴度。结果说明,cypa在氧化应激增强的hcmv复制中起着重要的辅助因子作用。四、p38-mapk信号通路对hcmv复制的调控过氧化氢刺激细胞后,Western-blot检测不同过氧化氢作用时间和作用浓度对细胞p38活性的影响,发现200μM过氧化氢刺激1h后,p38的磷酸化水平显著上调,6h后升至高点;同时在25μM过氧化氢刺激下,p38出现磷酸化,随着浓度的增加,p38磷酸化水平也随之升高;采用NAC以及p38抑制剂SB203580后,氧化应激诱导的p38磷酸化效应受到抑制,进一步说明氧化应激促进了细胞内p38的磷酸化;并在干扰或抑制CyPA后观察发现,CyPA也参与了氧化应激促进p38磷酸化的过程;为验证p38对HCMV复制的影响,利用SB203580预处理细胞,结果显示,SB203580能够抑制过氧化氢增强的HCMV复制;干扰或抑制CyPA后,p38在磷酸化水平受到抑制的同时HCMV的复制也受到抑制。综上,本研究全面探索了氧化应激对HCMV复制的影响,揭示了氧化应激是促进HCMV在细胞内复制的关键因素;体内和体外结果共同证实抗氧化剂是控制病毒感染复制的一种有效方式;干扰或抑制CyPA可阻碍氧化应激促进的病毒复制,说明CyPA是病毒复制中的重要辅助因子;从机制上阐明p38-MAPK信号通路在氧化应激与HCMV复制之间发挥重要作用,总结实验结果提出ROS→CyPA→p38-MAPK→HCMV的通路,对深入开展HCMV致病机制研究提供理论基础和实验支撑,为研发防治HCMV复制的药物提供新思路和新策略,也为防治HCMV感染提供实验数据和理论依据。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373

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