抗甲型流感病毒卵黄抗体的制备、活性评价及其应用研究

发布时间：2019-07-13 16:47

【摘要】：由于甲型流感病毒变异快、抗甲流病毒的化学药物毒副作用大,易产生耐药性,同时有效疫苗的制备难度很大,因此寻找一种安全、简便、高效的甲型流感防治药物成为目前具有挑战性的研究课题。卵黄抗体(Egg yolk immunoglobulin, IgY)具有来源广、特异性好、安全无残留、性能稳定及价格合理等优点,在病毒性疾病的预防、治疗和诊断方面具有广阔的应用前景。本课题采用灭活甲型流感病毒为抗原免疫产蛋鸡,制备特异性IgY,对IgY的体内外抗病毒活性及其在甲型流感病毒检测中的应用进行研究,为特异性IgY在甲型流感的预防、治疗及检测方面的应用提供理论依据。研究内容分为四部分：1抗甲型流感病毒卵黄抗体的制备1.1以灭活甲型H1N1流感病毒A/广东/732/2009(H1N1)pdm09和A/加利福尼亚州/7/2009(H1N1)pdm09毒株及季节性甲型流感病毒A/广东/622/2009(H1 N1)和A/广东/749/2009(H3N2)毒株为抗原分别免疫蛋鸡获得特异性IgY。采用PEG沉淀法得到IgY纯度95.80%,回收率93.01%。1.2经ELISA检测,不同抗原免疫产生的抗体效价随时间的变化趋势基本一致,1 mg/mL的IgY的最高效价达3200,最高效价在卵黄中可持续6周,高效价抗体(2500)在卵黄中可持续10周以上。2抗甲型H1N1流感病毒卵黄抗体的体外活性评价主要对抗甲型H1N1流感病毒A／广东/732/09(H1N1)pdm09 IgY的抗病毒活性进行了分子水平和细胞水平上的评价。2.1琼脂扩散和荧光免疫实验,结果表明IgY能与病毒颗粒结合并使其产生沉淀；Western Blot分析和HI实验,结果显示IgY能与病毒表面的主要膜蛋白神经氨酸酶(NA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)及基质蛋白(M)发生特异性结合,能有效抑制病毒对红细胞的凝集作用,1.0mg/mL的IgY能完全抑制红细胞凝集的最高稀释倍数为128。2.2空斑减数试验,结果说明IgY能有效中和病毒,直接抑制病毒对宿主细胞的吸附,IC50 2.0 μg/mL;能有效阻止病毒吸附于细胞；能抑制细胞内病毒的复制增殖；体外抗病毒作用明显、稳定。3抗甲型H1N1流感病毒卵黄抗体的小鼠体内抗病毒活性研究3.1 IgY对A/广东/732/2009(H1N1)pdm09感染小鼠的死亡保护作用将BALB/C小鼠随机分为15组,正常组,模型组,磷酸奥司他韦治疗组,抗A/广东/732/09 (H1N1)pdm09 IgY预防组(含大、中、小剂量3组)、治疗组(含大、中、小剂量3组)和预防-治疗组(含大、中、小剂量3组),阴性IgY中剂量预防组、治疗组和预防-治疗组。以5LD50的流感病毒液每只50.0gL滴鼻感染小鼠造模,正常组以生理盐水滴鼻对照。预防组在感染前2h给药1次；治疗组自感染后2h开始给药,每天1次,持续给药4天；预防-治疗组感染前2h给药1次,其他给药同治疗组。自造模当日起连续观察2周,计算各组存活率及体重保持率。结果显示：①模型组和阴性IgY各组的存活率都为10%。特异性IgY各组存活率≥90%,与模型相比较有极显著性差异,P0.001。②模型组和阴性IgY各组的小鼠体重均先下降,后缓慢上升,显著低于正常组。特异性IgY各组体重明显高于模型组。特异性IgY中剂量治疗组的体重变化和存活率与磷酸奥司他韦治疗组无差异。3.2 IgY对A／广东/732/09 (H1N1)pdm09感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响将BALB/C小鼠随机分为6组,正常组,模型组,磷酸奥司他韦治疗组,抗A/广东/732/09 (H1N1)pdm09 IgY中剂量预防组、治疗组和预防-治疗组。分别在感染后第3天和第6天随机处死小鼠,摘取肺脏。计算肺指数与肺指数抑制率,应用RT-PCR测定感染小鼠肺组织病毒载量,HA实验测定感染小鼠肺组织病毒滴度,HE染色光镜观察感染小鼠肺部组织的病理学变化。结果显示：①各个时间点,模型组与IgY各组的肺指数均有上升趋势,但IgY各组肺指数明显低于模型组。感染后第3天,IgY各组与模型组相比有显著性差异,P0.05；感染后第6天,IgY各组与模型组相比较有极显著性差异,P0.01。②各个时间点,模型组小鼠肺组织病毒载量和病毒滴度都明显高于IgY各组。IgY预防-治疗组与模型组相比较,具有极显著差异,P0.001；其他各组与模型组相比较,均具有极显著性差异,P0.01。③在病理组织切片中,IgY各组的肺组织结构基本完整,坏死与浸润级别低。4甲型H1N1流感病毒表面增强拉曼光谱免疫分析方法的建立与应用以柠檬酸三钠为还原剂成功制备金溶胶；用4,4'-联吡啶作为拉曼标记分子对金溶胶进行标记制备标记金溶胶；用IgY与标记金溶胶结合制备标记免疫金溶胶；标记免疫金溶胶与标记金溶胶的SERS图谱相一致。采用硅烷化、醛基化的方法在凹形载玻片上进行IgY的组装,制备固相抗体。优化实验步骤,建立表面增强拉曼光谱标记免疫分析检测甲型H1N1流感病毒的方法,对甲型H1N1流感病毒进行检测,病毒滴度在0.2 TCID50到2000 TCID50范围内,4,4'-联吡啶的SERS信号和抗原浓度呈线性关系,线性方程是Y=2348.4 X-1525.8,相关系数为0.9998。
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图片说明： 第一章绪论逡逑结构，共Ｈ层，从外到内一次为双层囊膜、基质蛋白和核壳体口，－２９１。Ａ型流感逡逑病毒颗粒的结构和组成如图１－１ＩＷ。逡逑在最外层的囊膜上分布着ＨＡ和ＮＡ两种糖蛋白，ＨＡ、ＮＡ根植于宿主逡逑来源的脂质双层膜中，因突出在病毒的外表面而称为刺突。蛋白Ｍ２称为离逡逑子通道，贯穿病毒的双层囊膜。逡逑：邋■邋！逡逑ＩＰＢ１逡逑？诗逡逑图１－１甲型流感病毒颗粒的结构和组成逡逑Ｆｉｇ．ｌ－ｌ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ａ邋ｖｉｒｕｓ邋ｐ；＂邋ｔｋｌｅ逡逑（引自邋Ｍａｒｋ邋ｖｏｎ邋Ｉｔｚｓ化ｉｎ邋等专著：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ｖｉｉ邋ｕｓＳｉａｌＵｌａｓｅ邋－邋Ａ邋Ｄｒｕｇ邋Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ逡逑Ｔａｒｇｅｔ，邋２０１１）逡逑中间层为球形蛋白壳，由基质蛋白Ｍｌ形成，位于脂质双层膜下面，与逡逑病毒囊膜内壁紧密接合，，共同构成流感病毒的外壳骨架，对保护病毒核屯、和逡逑维持病毒空间结构起着重要作用。逡逑５逡逑
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图片说明： 在ＨＡ的结构研究中，研究最透彻的是胞外区的结构。在１９８１、１９９４和逡逑１９９８ｆ＂－４＂年分别测定了融合前的构象、榞合后的构象和未切割前体所对应的逡逑晶体结构。结果显示如图１－２所示［＂１，ＨＡ１亚单位用呁色表示，ＨＡ２亚单位逡逑用红色表示，ＨＡ１的３２３位残基到ＨＡ２的１２位残基用绿色表示，病毒囊膜逡逑位于底部，球状头部位于顶部，ＨＡ１和ＨＡ２之间的切割位点存在与靠近一逡逑个深腔的环中。逡逑８逡逑
【学位授予单位】：广东工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392;O657.37

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本文编号：2514138