TGFβ信号通路介导激活成纤维细胞促进胚胎肝祖细胞向胆管发育的研究

发布时间：2019-07-15 11:17

【摘要】：背景和目的胚胎肝祖细胞可分化为成熟的肝细胞和胆管细。在胎肝发育中,分布在门静脉周围的肝祖细胞分化为胆管细胞,而分布肝实质中远离门静脉的肝祖细胞则分化为肝细胞。本研究探索TGFβ信号通路在胆管发育中的作用,及其可能的调控机制。方法第一部分:将分离得到的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)培养至第二代,分成4组,分别用普通培养液、5ng/m L TGFβ1、5ng/m L TGFβ1+10μM TGFβR1抑制剂(SB525334)及10μM TGFβR1抑制剂(SB525334)处理72h。用荧光激活细胞筛选法(FACS)分选DLK1表面抗原阳性的小鼠胚胎肝细胞,并和肌成纤维细胞或成纤维细胞Transwell共培养或者单独培养。细胞免疫荧光检测MEFs处理72h后α㧟SMA的表达,检测刚分选和共培养4、6d的DLK1+细胞的甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)及细胞角蛋白19(CK19)抗原的表达。q RT-PCR检测肌成纤维细胞和成纤维细胞α㧟SMA、HGF、TGFβ1、Jagged1、PTN、MDK、IGF1及IGF2等基因的表达,检测胎肝祖细胞共培养6d后,CK19、ALB、AFP、Sox9等基因表达。第二部分:孕10.5的C57孕鼠共8只,随机平均分成2组,药物干预组腹腔注射TGFβRI抑制剂SB525334(5mg/kg)(溶于2.2%DMSO和97.8%玉米油),对照组腹腔注射等量的2.2%DMSO和97.8%玉米油为对照组,每天注射药物,共干预8天。免疫荧光检测E14.5、E16.5、E18.5、P0、P10等各个阶段胎肝或肝脏的α㧟SMA、Sox9或CK19的表达,免疫荧光检测药物干预组和对照组E18.5胎肝α㧟SMA、Jagged1、Sox9、CK19的表达。q RT-PCR检测药物干预组和对照组E18.5胎肝α㧟SMA、Jagged1、Sox9、CK19基因的表达。免疫荧光试验计数周围区域门脉周围Ck19+细胞的数量,计数在中央区域门脉周围胆管的数量。然后计算每个动物中央区域的胆管数量/门静脉的比值和周围区域的胆管细胞数量/门静脉的比值。结果第一部分:FACS分析示DLK1+细胞占E14.5胚胎肝细胞比例约10%~20%。体外共培养24 h内分选的大部分DLK1+细胞开始分裂增殖,呈半贴壁生长。培养第2~3 d,细胞增殖明显呈葡萄状聚集生长,形态开始变成大圆形。共培养第4~6 d,部分细胞开始贴壁生长,并且形态成开始变梭形。细胞免疫荧光结果显示,FACS分选的DLK1+细胞表达AFP和少量ALB,但是不表达CK19。在共培养的第4天其开始表达CK19,和微弱表达ALB;第6天,其高表达CK19,而几乎不表达的ALB。以上结果说明分选DLK1+细胞大部分为m HPCs,与MEF共培养后可促进m HPCs增殖分化为胆管细胞。免疫荧光结果显示MEFs能被TGFβ通路激活转化为肌成纤维细胞。倒置显微镜下观察结果显示和肌成纤维细胞共培养6天后,m HPCs大部分细胞贴壁增殖,并形成树枝样胆管结构。而和成纤维细胞共培养组的m HPCs部分细胞贴壁增殖,部分细胞为圆形散在或成球增殖,未见树枝样胆管结构。免疫荧光结果显示肌成纤维细胞共培养组m HPCs的CK19的表达高于成纤维细胞组,而ALB的表达低于成纤维细胞组。q RT-PCR结果显示肌成纤维细胞共培养组m HPCs的CK19、Sox9基因的表达高于成纤维细胞组,而AFP、KI67基因的表达低于成纤维细胞组(P0.05)。细胞计数结果表明肌成纤维细胞共培养组的m HPCs子代细胞数量是成纤维细胞共培养组约2.5倍(P0.05)。以上结果说明同成纤维细胞相比,肌成纤维细胞促进胎肝祖细胞向胆管细胞分化作用更强,但抑制其增殖。第二部分:免疫荧光证实在E14.5~E18.5阶段,α-SMA+肌成纤维细胞主要分布在门静脉周围,出生后包绕胆管。此外,肌成纤维细胞为门静脉周围表达Jagged1的主要细胞,在胆管发育中起重要作用。阻断TGFβ信号通路后,中央区域的胆管数量/门静脉的比值和周围区域的胆管细胞数量/门静脉的比值明显减少(P0.05),说明TGFβ信号通路在胆管发育中发挥重要作用。当阻断TGFβ信号通路后,免疫荧光证实门静脉周围间质细胞α-SMA的表达减少,q RT-PCR检测进一步证实α-SMA基因的转录降低(P0.05),说明TGFβ信号通路调控门静脉周围间质细胞向肌成纤维细胞的转化。同时免疫荧光证实门静脉周围Jagged1的表达也相应减少,q RT-PCR检测进一步证实Jagged1基因的转录降低(P0.05),说明TGFβ信号通路调控门静脉周围的间质细胞向肌成纤维细胞的转化进而调控Jagged1表达。但胆管细胞Jagged1的表达未见减少,说明胆管细胞Jagged1的表达不受TGFβ信号通路的调控。在胆管发育中,Sox9为Notch通路的下游,阻断TGFβ信号通路后,门静脉周围Sox9+胆管细胞明显减少,q RT-PCR检测进一步证实Sox9基因的转录降低(P0.05),说明TGFβ信号通路可能通过Jagged1-Notch-Sox9机制途径调控胆管的发育。结论1.应用FACS技术成功从E14.5胎肝细胞中分选出DLK1+细胞并鉴定其大部分为m HPCs,在体外与MEFs Transwell共培养的条件下可扩增培养并诱导其分化为胆管细胞。2.在Transwell共培养的条件下,与成纤维细胞相比,肌成纤维细胞促进m HPCs向胆管细胞分化作用更强,但促进其增殖的能力较低。3.在动物体内,TGFβ信号通路在肝内胆管的发育中起重要作用,可能通过Jagged1-Notch-Sox9机制途径调控胆管的发育。
文内图片： FACS分选E14.5胎肝中DLK1阳性细胞率

图片说明：重庆医科大学硕士研究生学位论文3 结果3.1 FACS 分选的 DLK1 阳性细胞得率及鉴定本实验中, 采用酶消化法平均每个 E14.5 胎肝可得到有核细胞总数约（2~3）×106。用 FACS 分选技术将 E14.5 胎肝中 DLK1 阳性细胞分选出来, 7-AAD 排除死亡细胞, DLK1+细胞占胚胎肝细胞比率为 10 %~20 %（图 1.1）。
文内图片： FACS分选DLK1阳性细胞初步鉴定Fig1.2IdentificationofDLK1+cellsbyimmunocytochemicalmethod（A~D×400;E~F×100）

图片说明： 22图 1.2 FACS 分选 DLK1 阳性细胞初步鉴定Fig1.2 Identification of DLK1+cells by immunocytochemical method（A~D×400; E~F×100）注：A. DAPI； B. AFP； C. ALB； D Merge； E. DAPI ； F. CK19； G Merge3.2 体外共培养的 mHPCs 的生长特性倒置显微镜观察显示新分选出来的细胞大小均一, 呈小圆形, 核质比高（图1.3A）。培养 24 h 后, 大部分细胞开始分裂增殖（图 1.3B）, 培养第 2~3 天细胞增殖明显, 细胞体积变大, 呈松弛的葡萄状（图 1.3C）。形态及增殖特性方面显示, 分选出来的细胞即为 mHPCs。但继续培养到第 4~6 天, 部分细胞开始贴壁, 形态开
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R321

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