基于甲型流感病毒红细胞凝集素颈部保守区表位免疫原的设计及其功能活性的研究

发布时间：2019-08-12 07:29

【摘要】：流感病毒分为甲、乙、丙三种型别,其中甲型流感病毒(IAV)作为引起流感大流行的主要型别,是威胁人类健康最主要的病原体之一。IAV在各年龄段人群中具有高传染性,尤其在老人、儿童和免疫缺陷患者中更易传播。据记载,1918年、1957年和1968年的流感大流行夺走了近5000万人的生命。据世界卫生组织统计,全球每年有5%~15%的人口感染流感,其中严重病例300万~500万人,25万~50万人死于其导致的并发症。流感病毒的防治方法包括药物治疗和疫苗预防,其中药物治疗主要应用神经氨酸酶抑制剂和离子通道阻滞剂,但随着抗病毒药物的广泛使用甚至滥用,导致了耐药性毒株的出现,严重影响了抗流感病毒药物的治疗效果。流感疫苗由于具有预防性、保护性及较低副作用而成为预防流感流行的研究热点。目前,市售的流感病毒疫苗主要包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗,每种疫苗均含有甲型H1亚型、H3亚型和乙型三种流感病毒或抗原组份。由于以上三价疫苗所含病毒亚型覆盖面较广、生产工艺较为完善,因此成为现阶段主流的抗流感病毒疫苗。然而,流感病毒具有较高的抗原突变性,疫苗毒种的选择成为疫苗开研发的主要问题。目前季节性三价流感疫苗毒种的选择是根据世界卫生组织(WHO)基于前一季节的病毒循环抗原预测获得,然而这种预测很难覆盖流感病毒的抗原转变。因此,研究者亟需研发一种广谱、持久的通用型流感疫苗。近年来,随着H1N1、H3N2、H5N1和H7N9等流感疫情的逐年递增,广谱流感疫苗的研发对于增强我国流感的预防控制能力尤为重要。研究表明,基于流感病毒的保守性蛋白(如基质蛋白和表面蛋白等)研发的候选疫苗,可以在小鼠中诱导产生高水平的中和抗体,这为广谱流感疫苗的研发提供了新的空间。由于甲型流感病毒的红细胞凝集素(HA)蛋白是主要的诱发保护性免疫反应的抗原位点,同时HA颈部序列保守性较强,所以基于流感病毒表面HA蛋白的候选疫苗的研发尤为集中。然而,基于高保守性HA蛋白的候选疫苗仍然存在缺点。首先,大多数广谱中和抗体的诱导依赖空间、非连续性表位,为疫苗的生产、纯化增加了难度。其次,一些中和抗体的中和机理尚不明确,不利于广谱流感疫苗的深入研发。同时,由于高保守性蛋白亚单位疫苗及表位疫苗免疫原性较低,如何提高候选疫苗的免疫原性也成为了不可忽视的问题。因此,广谱流感疫苗成功的关键是要同时具备高免疫原性和广谱保护性。鉴于现阶段已经明确的流感病毒HA颈部功能区靶位抗体跨序列锚定HA1及HA2抑制变构的中和机理,本研究的目的是设计一种新型的表位多肽免疫原,此免疫原需包含简短的、线性优势表位,并具有较强免疫原性、中和活性及明确的中和机理。然后,经过免疫原优化设计,进一步增加其免疫原性、广谱中和活性及保护性。本论文主要分为以下两个部分:第一部分:H3亚型IAV HA颈部保守区的多肽免疫原设计及中和机理的研究由于流感病毒序列的高突变性及免疫保护过程中的病毒结构易变性,现阶段可获得的经典流感病毒疫苗很难诱导或增强广谱中和抗体的产生。而解决此问题的有效方法之一是了解广谱中和抗体的中和机理,从而找到流感病毒与宿主膜融合过程中的中和位点。自1968年流感大流行起,H3N2流感病毒就一直持续导致人类极高的患病率及病死率,所以本部分实验首先针对1968年至2014年间10,763株H3N2流感病毒序列进行序列分析、B细胞及MHC-II类分子T细胞表位预测,从中获得了高度保守(保守率:97.59%±0.62%)的HA颈部片段及六条衍生多肽免疫原序列(P1~P6)。通过免疫原性检测,我们确定了P6多肽序列中含有潜在的B细胞及MHC-II类分子T细胞表位,并且基于P6多肽序列的MAP4及以KLH为载体的免疫原都能够诱导较强的体液免疫反应(抗体效价:log104.14~4.74)和H3亚型内交叉毒株中和活性(ID50:564.57~1408,P0.005)。经过对已知的H3亚型IAV的HA晶体结构分析,发现P6多肽序列位于病毒膜融合过程中HA2的变构拐点处,进一步通过酸旁路实验及膜融合动力学试验,我们提出并验证了P6多肽免疫原所诱导的中和抗体的中和机理:锚定HA2变构拐点,通过空间位阻抑制膜融合过程中HA2的变构从而抑制膜融合。此段高保守性HA2颈部表位的设计及中和机理的确定能够为未来流感疫苗的设计应用及流感病毒临床免疫治疗提供参考。第二部分:三价流感表位嵌合No V P particle免疫原设计及诱导广谱中和抗体的研究流感病毒HA2颈部功能区具有亚型内高度的保守性及中和抗体的靶向性,具备成为广谱流感病毒候选疫苗的潜力。基于前期建立的实验基础及提出的中和机理,我们通过序列分析及B细胞表位预测分别筛选出H1亚型和B型HA2颈部高保守功能表位(H1保守率:97±0.123%,B型保守率:99.98±0.003%),联合已知的H3亚型P6表位,共同表达于No V P particle的三个环区上,制备出三价嵌合重组蛋白免疫原(Trivalent HA2-PP)。通过动物免疫、不同亚型病毒微中和检测、体外保护性检测,Trivalent HA2-PP诱导产生了针对各亚型HA2表位显著的体液免疫反应(log104.39~5.15),并且可以通过病毒交叉免疫加强特异性抗体效价,同时诱导的抗体在体外针对H3、B亚型流感病毒具有较强中和活性(ID50:45~656,P0.05)。同时,Trivalent HA2-PP的免疫在小鼠A/Texas/JMM_30/2012(H3N2)攻毒试验中表现出良好的H3亚型体内保护性。本研究证明以HA2为基础的三价嵌合No V P particle免疫原的设计能够为流感病毒广谱候选疫苗的研发提供理论与实验参考。综上所述,本研究成功的设计、制备和评价了流感病毒HA2颈部保守区表位多肽免疫原,此种免疫原具有较高的免疫原性,所诱导中和抗体具有较强体外保护性。同时提出并验证了所诱导中和抗体的中和机理,即锚定HA2变构拐点,并以空间位阻抑制膜融合。此外,我们将免疫原筛选方法及抑制机理推广至多亚型流感病毒并应用于No V P particle载体表达系统,成功的制备和评价了新型流感病毒三价重组蛋白疫苗。此疫苗具有更高的免疫原性及较好的体外、体内保护性。因此,本论文中所设计的IAV HA2颈部功能区多肽免疫原及其重组蛋白免疫原均具有成为新一代的广谱流感候选疫苗的潜力。
【图文】：

段 RNA 链）编码 10 种不同的蛋白质，如图 1.merase）蛋白（PB2、PB1 和 PA）、1 种核蛋白蛋白 HA 和 NA、2 种基质蛋白（Matrix protein及 2 种非结构蛋白（Non-structral protein 1，NS[3]。

大流行的病毒传播模式、疾病严重程度及死亡情l烈灿泻艽蟮牟钜臁Ｔ，

本文编号：2525565