白念珠菌HSP90 C端结构和功能的研究

发布时间：2019-10-29 00:52

【摘要】：白念珠菌是人体的一种共生菌,在一定条件下可以转变为一种致病菌,临床调查表明白念珠菌已经成为全球一种普遍流行的致病真菌。白念珠菌主要通过感染人体内部脏腑以及血液致病。通过对白念珠菌相关文献的查阅我们发现白念珠菌的致病性以及耐药强度在逐年增强,其中热休克蛋白90参与的白念珠菌pck1通路在提高白念珠菌的生长速度以及增强对唑类等抗菌药物的耐药性方面有重要意义[1]。HSP90的辅助功能与其蛋白结构密切相关,尤其是N端和C端的部分关键氨基酸位点对真菌HSP90的功能有重要作用[2]。我们通过蛋白质软件分析发现,白念珠菌HSP90与人源HSP90碱基序列同源性接近65%,而C端的差异性较大。这个发现为研发白念珠菌HSP90较高特异性抑制剂靶点提供了一定的理论依据。基于两者序列差异的相关文献以及软件以及计算机软件分析结果发现白念珠菌中CaHSP90(1-673)以及CaHSP90(1-655)对于CaHSP90的二聚体形成可能会产生一定的影响,而其相对应人源HSP90部分为hHSP90(1-679)和hHSP90(1-696),根据上述的认识我们发现,通过研究白念珠菌HSP90与人体HSP90结构差异去发现CaHSP90的特异性较高的耐药靶点,从而提高白念珠菌的药物敏感性。前期我们成功完成了体外质粒的构建,初期主要是通过酶切技术将SC5314实验室标准菌株的CaHSP90,CaHSP90(1-673)以及CaHSP90(1-655)的基因序列装入PET22b质粒中,中期我们通过在大肠杆菌胞内表达,用His-镍柱蛋白纯化技术纯化了CaHSP90以及CaHSP90(1-673),CaHSP90(1-655),hHSP90以及hHSP90(1-679),hHSP90(1-696)这些蛋白,后期我们用Superdex200蛋白制备分析柱等技术对CaHSP90,CaHSP90(1-673)以及CaHSP90(1-655),HSP90以及hHSP90(1-679),hHSP90(1-696)这些蛋白进行了质量计算和蛋白结构功能的分析。我们还研究了CaHSP90的蛋白质结构变化对于化学修饰的影响,最后我们进行了HSP90,CaHSP90(1-673)以及CaHSP90(1-655)的ATPase活性检测实验。结果:通过PCR技术和生物公司的测序证明我们在体外成功构建了相关质粒,蛋白电泳结果显示复制的质粒能够在大肠杆菌BL21感受态细胞中成功表达。通过Superdex200制备柱我们发现CaHSP90(1-655)与hHSP90(1-679)存在结构差异,CaHSP90(1-655)是在单体与二体之间,hHSP90是二体。CaHSP90,CaHSP90(1-673),hHSP90以及hHSP90(1-696)都形成了寡聚,寡聚的形成与温度以及C端结构的变化有关,内在具体机制仍待研究。
【图文】：

图 2 载体质粒结构图注.目的基因主要插入在黑色条带中的Nde1和Xho1如图所示，该质粒总共为5493bp该质粒为氨苄抗性，并标有 his—tag 标签。1.CaHSP90，CaHSP90（1-673），CaHSP90（1-655）基因 PCR电泳结果如下图所示 PCR 结果显示 1 号泳道 CaHSP90 为 2124bp，2 号泳道 CaHSP90（1-673）为 2019bp，3 号泳道为空白，4 号泳道 CaHSP90（1-655）为 1965bp，可以看出三条目的基因条带都较清晰，，特异较高

图 3 PCR 电泳结果图图 3 1 泳道:CaHSP90，2 泳道：CaHSP90（1-673），3 泳道：空白，4 泳aHSP90（1-655）. CaHSP90, CaHSP90（1-673），CaHSP90（1-655）菌液 PCR 结如下图我们主要是根据菌液 PCR 鉴定我们所要研究的目的基因 1 号和 4 号
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R379.4


本文编号：2553301