嗜酸性乳杆菌MG株S层蛋白的高级结构预测分析及原核表达

发布时间：2019-11-03 02:47

【摘要】：以嗜酸性乳杆菌MG株slp基因(表达S层蛋白的基因)为材料,应用Genetyx软件推导出其正确的开放阅读框(ORF),并用CPHmodels,Swiss-Model和Swiss-PdbViewer生物软件预测SLP蛋白质的高级结构;此外,构建slp基因的原核表达载体pGEX-slp,经IPTG诱导后,成功表达出重组S层蛋白(S-layer protein,SLP),并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明,使用3种不同的软件预测SLP蛋白质的高级结构,预测结果具有很高的相似性,其中α螺旋占3.33%,线性结构占45%,无规则卷曲占51.67%,平均亲水值为-0.262,亲水氨基酸比例为59.1%;表达载体pGEX-slp在E.coli BL21中经IPTG诱导成功表达出重组SLP蛋白,其GST融合蛋白的大小约为70ku。本研究结果为进一步以SLP为材料的生物制品的制备和应用开发奠定了基础。
【图文】：

Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ５０００；１．ＰＣＲ产物Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ５０００；１．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ图１ｓｌｐ基因的ＰＣＲ扩增产物Ｆｉｇ．１ＴｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｌｐｇｅｎｅｂｙＰＣＲ２．２重组载体ｐＧＥＸ－ｓｌｐ的酶切鉴定和ＰＣＲ鉴定嗜酸性乳杆菌ｓｌｐ基因大小约为１２００ｂｐ，ｐＧＥＸ－４Ｔ－３大小约为５５００ｂｐ，将重组质粒ｐＧＥＸ－ｓｌｐ用ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切后，在琼脂糖凝胶电泳图谱上，分别出现约５０００ｂｐ和１２００ｂｐ左右的特异性条带（图２）。ＰＣＲ鉴定结果如图３所示，，在２０００ｂｐ和１０００ｂｐ之间有一特异性条带，符合理论值１２６０ｂｐ的大校２．３嗜酸性乳杆菌ＳＬＰ蛋白质的氨基酸序列预测应用Ｇｅｎｅｔｙｘ生物软件推导出的ＳＬＰ蛋白质氨基酸序列，嗜酸性乳杆菌ＭＧ株的ＳＬＰ蛋白共由４１４个氨基酸组成（图４）。２．４ＳＬＰ蛋白质的高级结构预测应用３种在线软件对ＳＬＰ蛋白质进行高级结构预测结果如图５（Ａ～Ｃ）所示，３种不同软件预测出３Ｄ空间结构惊人相似，表明预测结果的高重复性。２．５ＳＤＳ－ＰＡＧＥ与Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果对重组菌经ＩＰＴＧ诱导表达后的产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析。如图６所示，ＩＰＴＧ诱导５ｈ后在７０ｋｕ处出现了条带（第２泳道），而未加ＩＰＴＧ的同一个菌样在同一时间未出现类似条带（第１泳道）。以鼠抗ＧＳＴ血清为一抗，对ＩＰＴＧ诱导表达产物进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏ

ｌｐ）约在７０ｋｕ处出现特异性条带，与ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果相符，并在２７ｋｕ处也出现与对照组样品（含ｐＧＥＸ－４ｔ－３空质粒）相同的条带（泳道２）。而对照组样品（含ｐＧＥＸ－４ｔ－３空质粒）除了２７ｋｕ处的特异性条带以外还有一条明显大于７０ｋｕ的非特异性条带（泳道１）。Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ５０００；１．ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ５０００；１．ＤｉｇｅｓｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙＢａｍＨⅠ／ＸｈｏⅠ图２重组载体的ｐＧＥＸ－ｓｌｐ的双酶切鉴定Ｆｉｇ．２ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｍｉｄｐＧＥＸ－ｓｌｐｂｙＢａｍＨⅠａｎｄＸｈｏⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ．ＤＮＡ标准ＤＬ５０００；１，２．ＰＣＲ产物Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ５０００；１，２．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ图３重组载体的ＰＣＲ鉴定Ｆｉｇ．３ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－ｓｌｐｂｙＰＣＲ图４ＳＬＰ蛋白质的氨基酸序列Ｆｉｇ．４ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＳＬＰｐｒｏｔｅｉｎ２０动物医学进展２０１３年第３４卷第４期（总第２３８期）

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本文编号：2554849