戊型肝炎假病毒颗粒的制备及其稳定性研究

发布时间：2019-11-03 11:32

【摘要】：目的利用装甲RNA技术制备一种能够应用于戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)核酸检测的阳性质控品,为临床上HEV核酸分子水平检测提供可靠的质控工具,为相关HEV的诊断试剂盒研发奠定理论与技术基础。方法设计将MS2噬菌体基因组的5’端部分非编码区、成熟酶蛋白、衣壳蛋白以及部分复制酶起始位点等编码基因与HEV ORF2/ORF3保守区部分基因序列串联并合成目标基因MS2-HEV。并将MS2-HEV基因克隆、插入原核表达载体p ET-28b中构建p ET-28b-MS2/HEV重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导培养4小时后,SDS-PAGE鉴定表达情况;将验证的表达菌体首先经过超声破碎、离心、取上清、去除核酸杂质后再经超滤离心纯化、浓缩,电镜分析鉴定假病毒形态;稳定性检测包括DNase I、RNase A抗性试验以及在血液中保存期检验三个方面,最终确定假病毒稳定性参数。结果1、PCR鉴定及测序结果证明重组质粒p ET-28b-MS2/HEV成功构建,SDS-PAGE电泳检测到14k Da的位置出现目的条带表明重组MS2-HEV基因获得有效表达,超滤离心纯化后的重组假病毒颗粒仅有一条目的带无杂带表明假病毒得到高纯度纯化浓缩。2、电镜鉴定结果发现直径约27nm二十面体对称的假病毒颗粒,说明假病毒组装成功。RT-PCR鉴定得到349bp大小的目的条带,这些结果表明设计的HEV保守基因序列成功地被包装到重组HEV假病毒颗粒中。3、病毒颗粒稳定性试验结果表明制备的HEV假病毒能够有效抵抗高浓度的DNase I和RNase A的降解作用,并且放置在血液中的假病毒颗粒,-20℃条件下可以持续保存六个月而无明显降解。结论本研究成功的制备出HEV假病毒颗粒,并且该HEV假病毒颗粒具有很强的稳定性及仿真性,达到了作为RNA病毒核酸检测阳性质控品的基本要求。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373.21

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本文编号：2555058