小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及其在肝内归巢

发布时间：2019-11-16 21:20

【摘要】：目的建立小鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)分离培养的方法,并将ADSCs移植于体内,观察其致瘤性及肝脏归巢情况。方法取皮下脂肪用0.075%Ⅰ型胶原酶消化,贴壁培养获取小鼠ADSCs,通过流式细胞技术检测其表面分子、细胞周期;并将ADSCs注射到小鼠皮下观察其致瘤性,及尾静脉注射观察其肝脏的归巢。结果分离培养的细胞高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45、CD11b、CD14;细胞周期显示G0/G1、S、G2/M的细胞所占的比例分别为80.1%、7.9%、12%;ADSCs具有低免疫原性,不表达CD40、CD80、CD86、MHCI、MHCII以及PDL-1。在IFN-γ作用下,可轻度上调CD40、CD80以及PDL-1。ADSCs移植后未见成瘤,且可在肝脏实质内多处定居。结论胶原酶消化、贴壁培养可以从小鼠脂肪中分离出高纯度的间充质干细胞,且ADSCs移植后能在肝内定居。
【图文】：

；每毫升细胞悬液中加入1μlCFSE，，5%CO2培养箱37℃孵育15min，期间注意混匀，全培洗涤2遍。用高糖DMEM将细胞重悬成1×107/ml；由尾静脉注射100μl到正常BALB/c小鼠体内（n=3）。7d后制取肝脏冰冻切片，DAPI染色后荧光显微镜下观察。以正常BALB/c小鼠的肝脏做对照。2结果2.1小鼠ADSCs的形态学观察小鼠ADSCs接种于培养皿24h后，可见细胞已经贴壁，48hr后换液去除非贴壁细胞，可见细胞已经生长出触角，呈梭形或三角形；开始几天细胞生长缓慢，生长1周左右，细胞60%~70%融合，成纤维样生长，细胞形态一致（图1），之后细胞增殖速度明显加快，很快能够达到90%以上融合状态，呈螺旋状生长。2.2小鼠ADSCs表面标志物的表达细胞传代纯化后取第3代ADSCs进行流式检测CD29、CD90（间充质干细胞标志物），CD34（造血干细胞标志物），CD45（白细胞标志物），CD14（单核细胞标志物），CD11b（巨噬细胞标志物）等表达，如图2A，B所示，分离培养的ADSCs高表达CD29（99.8%）和CD44（93.7%）；CD34、CD45、CD11b和CD14的峰与ISOTYPE（同型对照）峰完全重叠，阳性率为0，说明ADSCs不表达CD34、CD45、CD11b和CD14。ADSCs具有低免疫原性，因此我们检测了其表面免疫相关分子的表达。流式细胞仪结果显示，小鼠ADSCs不表达CD40，CD86，PDL-1，MHCI以及MHCII，这些免疫分子的峰与阴性对照峰完全重叠；CD80的峰较同型对照峰稍右移，表现为低表达CD80（图2C）；而在IFN-γ刺激下，CD80、CD86、PDL-1的峰较同型对照峰右移，表现出轻度上调（图3），其它免疫相关分子无明显变化。2.3小鼠脂肪间充干细胞的细胞周期检测原代ADSCs长满后，收集细胞进行细胞周期分析：G0/G1、S、G2/M的细胞所占的比例分别为80.1%、7.9%、12%。分离培养的细胞大部

其它无明显的变化。而且有学者发现ADSCs在体外不能刺激细胞毒性T细胞反应［12］，这些都为ADSCs的同种异体移植时逃逸宿主免疫监控提供了理论上的可能。间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能，最早在2005年报道细胞因子cocktail法可以诱导ADSCs向肝样细胞诱导［13］，ADSC能够分泌细胞因子和肝再生生长ventsE10010110210393.7%ISOTYPECD442560AventsE10010110210399.8%ISOTYPECD292560BventsE100101102103ISOTYPECD802560C图2小鼠ADSCs表面标志物和免疫分子的表达Fig.2Surfaceandimmune-relatedmarkersexpressions(red)onmouseADSCs.A:CD44;B:CD29;C:CD80.ISOTYPE:Negativecontrol(Black).ventsE100101102103ISOTYPECD402560AventsE100101102103ISOTYPECD802560BventsE100101102103ISOTYPEPDL-12560C图3IFN-γ对小鼠ADSCs表面免疫分子表达的影响Fig.3EffectofIFN-γontheexpressionofimmune-relatedmarkersonADSCs.A:CD40;B:CD80;C:PDL-1.图4小鼠ADSCs的肝内归巢Fig.4CellhomingtotheliverofmouseADSCs.A:DAPI;B:CFSE;C:DAPIandCFSEoverlay.ABCOverlayCFSEDAPIhttp://www.j-smu.comJSouthMedUniv,2013,33(8):1151-1154··1153

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本文编号：2562007