自噬在真核细胞对鲍曼不动杆菌的清除中的作用的研究

发布时间：2020-01-27 22:45

【摘要】：鲍曼不动杆菌（A. baumannii）是一种革兰阴性的机会致病菌，能够导致多种感染性疾病，感染尤其易出现在免疫缺陷、昏迷、术后、创伤后及一些慢性疾病的住院患者中。鲍曼不动杆菌感染所致死亡率在19-54%之间，其耐药株的流行及其在环境中生存能力强等原因，都使其越来越引起人们的重视。鲍曼不动杆菌此前一直被认为是胞外菌，但近年来多项研究表明，鲍曼不动杆菌能够粘附、侵入多种哺乳动物细胞，并能够在宿主细胞中生存。但宿主免疫与鲍曼不动杆菌感染的关系和机仍不明确。自噬是一种细胞程序化死亡过程，也是真核生物进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程，对于细胞在饥饿状态下得以存活，自噬起到非常重要的作用，它能够清除一些多余的或老化的细胞器，以此维持代谢的平衡和某些细胞器的更新。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，形成自噬小体，自噬小体通过与溶酶体融合，最终在自噬溶酶体中降解。自噬已被发现与机体控制多种细胞内微生物感染有关，鲍曼不动杆菌是否会介导自噬的发生，自噬对鲍曼不动杆菌的感染有何作用，尚无文献报道。本课题组对鲍曼不动杆菌在哺乳细胞中是否能诱导自噬反应进行了探索。本研究旨在明确鲍曼不动杆菌是否能诱导哺乳细胞发生自噬，并在此基础上研究其发生的起始过程（哪些配体蛋白参与）、信号通路及该自噬反应对感染结局的影响，并探讨在此反应中鲍曼不动杆菌的关键因子。本研究采用LC3荧光表达蛋白质粒转染HeLa细胞后感染鲍曼不动杆菌，应用自噬诱导剂预处理及用自噬抑制剂预处理后感染鲍曼不动杆菌，在共聚焦显微镜下观察LC3荧光斑点形成情况；应用透射电镜观察鲍曼不动杆菌感染的HeLa细胞的自噬小体等结构，以证实自噬的发生；应用蛋白印迹法检测感染鲍曼不动杆菌的细胞的LC3表达情况，通过计算LC3-II/LC3-I比值来评判细胞自噬程度；通过免疫荧光染色法，研究胞内鲍曼不动杆菌菌体与致敏蛋白的共定位关系，以判断哪些蛋白参与了自噬的起始过程，应用RNA干扰技术，敲除其中的某些蛋白后的细胞感染鲍曼不动杆菌，通过免疫荧光染色及Western方法，判断细菌与其他致敏蛋白共定位情况及LC3表达情况来明确某些蛋白在菌体致敏自噬过程中的作用；通过免疫荧光染色技术及蛋白印迹技术，检测胞内菌体与LC3斑点、酸化溶酶体及LAMP1的共定位关系及p62在感染细胞中的表达情况，明确该自噬是否为完全自噬；应用RNA干扰技术及信号通路特异性抑制剂，通过共聚焦显微镜观察及蛋白印迹技术检测LC3表达情况，研究该自噬的信号通路；应用鲍曼不动杆菌野毒株及其磷脂酶D突变株感染HeLa细胞，通过蛋白印迹技术检测LC3表达情况，研究磷脂酶D对该自噬的影响，并进而通过磷脂酶D原核表达及免疫荧光技术，研究磷脂酶D对该自噬的影响的作用位点；最后，通过琼脂糖平板细菌涂板及共聚焦显微镜观察，鲍曼不动杆菌感染巨噬细胞，明确自噬对鲍曼不动杆菌细菌清除的影响。结果如下：（1）我们用鲍曼不动杆菌感染HeLa细胞，通过共聚焦显微镜观察及蛋白印迹法发现鲍曼不动杆菌可以诱导HeLa细胞发生自噬反应，并通过透射电镜观察证实了感染鲍曼不动杆菌的HeLa细胞内自噬小体的形成。本研究也通过免疫荧光染色、蛋白印迹等方法，证实了该自噬为完全性自噬。（2）鲍曼不动杆菌诱导的自噬是通过泛素E3连接酶LRSAM1与泛素化蛋白包绕菌体，并与募集的自噬的配体蛋白NDP52及p62/SQSTM1作用而启动的。敲除骨架蛋白sept2和sept9后，，感染鲍曼不动杆菌的细胞的p62/SQSTM1和NDP52不能在菌体周围募集，鲍曼不动杆菌诱导的自噬受到抑制，从而说明鲍曼不动杆菌诱导的自噬依赖于骨架蛋白成分。通过应用RNA干扰技术、特异性蛋白抑制剂，发现Beclin-1/Atg7/Atg8、MEK/ERK及AMPK-mTOR-ULK1信号通路参与了鲍曼不动杆菌诱导哺乳细胞的自噬反应的发生。（3）最后，我们通过琼脂糖涂板及光学观察方法，应用自噬诱导剂及抑制剂，证实了自噬能够促进宿主细胞对胞内鲍曼不动杆菌的清除。综上所述，本实验首次发现并证实了鲍曼不动杆菌能够诱导哺乳动物细胞发生自噬反应，也明确了自噬对鲍曼不动杆菌感染的作用，为鲍曼不动杆菌感染的治疗提供了新思路。本研究的创新点在于国内外率先开展对鲍曼不动杆菌引起自噬现象及自噬对鲍曼不动杆菌感染的影响进行系统研究，并对其发生机制、信号途径及鲍曼不动杆菌参与自噬的蛋白分子进行深入探索。
【图文】：

鲍曼不动杆菌,基因,耐药

第 1 章文献综述适应环境压力，并能做出改变的能力。鲍曼不动杆菌对天然耐药机制的不为一个多重耐药的病原体。鲍曼不动杆菌具有强大的获得耐药性和克隆传重耐药、广泛耐药、全耐药鲍曼不动杆菌呈世界性流行，已成为我国院内病原菌之一。曼不动杆菌在抗生素压力下，比如在一个高危环境下（在医院监护病房中被广泛使用），有捕获抗性基因的能力，基因多态性分析也印证了，鲍曼分的耐药基因都是新近从绿脓杆菌、沙门菌属或大肠杆菌获得的（Fou。还有一些耐药基因来源于遗传，也有一些遗传基因来源于偶然的突变。（动杆菌耐药性的出现可能是病人间相互传播的征象，也可以当成是鲍曼不发的一个预兆（Villegas，2003）。

模式图,自噬,分子伴侣,模式图

图 1.2 大自噬、微自噬及分子伴侣介导的自噬的模式图Figure1.2 Model cart of macroautophagy, microautophagy and chaperone-mediatedautophagy1.3.2.2.1 大自噬对泛素-蛋白酶体系统的研究揭示了细胞生物学中控制蛋白质降解的不同的关键方面。泛素-蛋白酶体系统主要局限于针对哪些被破坏的蛋白，但细胞也需要处理更的受损的、可能有毒性的或多余的结构，这些结构中也包括完整的细胞器，而这都是噬能涉及的功能范围（Yang，2010）。细胞质里的某些胞质内容物或一些细胞器被隔进一个双层膜结构中，这个双层膜结构通过延伸和闭合，形成一个封闭的双层膜结构囊泡，被称为自噬小体，自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体。最后在自噬溶酶体中来自溶酶体的各种水解酶把这些内容物降解、重新释放回胞质内循环再利用。这个过称为大自噬，即我们通常所说的自噬。（图 1.2）大自噬是介导细胞成分降解的主要
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378

【共引文献】