降钙素原基因克隆表达及多克隆抗体的制备

发布时间：2020-01-27 05:51

【摘要】：目的克隆、表达降钙素原(PCT),制备相应的多克隆抗体。方法根据GenBank上PCT的基因序列,设计10条用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技术扩增PCT基因并构建pGEX-KG-PCT重组质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白PCT-GST,然后用融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot法进行生物活性鉴定,并利用琼脂免疫扩散实验检测了多克隆抗体的特异性和效价。结果成功获得PCT全长基因,重组质粒pGEX-KG-PCT在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE电泳显示蛋白相对分子质量(Mr)大小为36 000左右。利用纯化的蛋白同时制备了GST和PCT-GST多克隆抗体,琼脂免疫扩散实验显示多克隆抗体可以特异性识别PCT,效价为1∶4。结论成功克隆、表达并纯化出PCT蛋白,制备了相应的多克隆抗体。
【图文】：

A:PCR扩增PCT基因结果．M:DNAmarker(20bpladder);1:PCT基因;B:pGEX-KG-PCT重组质粒双酶切结果．M:DNAmarker(100bpladder);1:双酶切条带．图1PCR基因的克隆和pGEX-KG-PCT重组质粒鉴定2．2目的蛋白的鉴定SDS-PAGE电泳的结果显示，含重组质粒pGEX-KG-PCT和pGEX-KG的菌经IPTG诱导表达后在对应Mr位置均出现相应的蛋白带，其大小与预测的融合蛋白的Mr大小一致。GST蛋白位于Mr29000左右，PCT-GST蛋白大小Mr为41000左右，融合蛋白有部分降解(图2)。M:蛋白Mrmarker;1:PCT-GST融合蛋白;2:GST蛋白对照．图2SDS-PAGE检测重组PCT-GST蛋白和GST蛋白2．3Westernblot鉴定抗血清生物学活性用Westernblot法检测重组蛋白免疫兔的抗血清，血清稀释1∶500，可以得到清晰的条带，，证明制备的多克隆抗体可以有效识别重组蛋白(图3)。5期谭倩，等．降钙素原基因克隆表达及多克隆抗体的制备505

生物学活性,重组蛋白,多克隆抗体

M:蛋白Mrmarker;1:PCT-GST融合蛋白;2:GST蛋白对照．图3Westernblot法鉴定重组蛋白生物学活性2．4PCT多克隆抗体的特异性和效价琼脂免疫扩散实验结果证实PCT多克隆抗体可以特异性识别PCT蛋白(表1)，多克隆抗体效价为1∶4。表1琼脂免疫扩散实验检测PCT抗体特异性和效价抗原PCT多克隆抗体1∶11∶21∶41∶8GST±－－－PCT－GST++±－注:“±”为沉淀线模糊;“+”为沉淀线清晰;“－”为无沉淀线．3讨论已证实PCT是一个具有高灵敏度、特异性的新指标，比其他实验室指标(如C反应蛋白)能更早期鉴别细菌与非细菌感染［5－7］。PCT在临床诊断中已成为判断细菌早期感染的一项重要指标［8－9］。目前，PCT的检测有高效液相色谱法、胶体金和化学发光法等［10］。所用到的抗体主要为PCT单克隆抗体，但因试剂、仪器昂贵等原因使PCT检测项目在我国难以推广。利用多克隆抗体检测PCT是使检测费用降低的有效途径，但多克隆抗体存在特异性不高，灵敏度低等问题。因此，提高PCT多克隆抗体特异性和灵敏度是建立低廉快速检测方法的前提条件。本项研究选用PCT-GST融合蛋白制备多克隆抗体，主要考虑到GST融合蛋白易于纯化，且GST融合蛋白易于溶解，能产生较高效价的抗血清。由于多克隆抗体是用PCT-GST融合蛋白免疫兔制备，所以其与GST有一定的交叉反应(表1)，但其反应程度要远远低于PCT-GST蛋白，将PCT抗体1∶2稀释后即无沉淀线产生;表明多克隆抗体可特异性识别PCT。人体血清中GST含量极低，目前没有报道表明GST含量在正常人和病人中有显著性差异，因此，所制备的PCT多克隆抗体具有较好的特异性，可以用于PCT的实验诊断。下一步工作便是找到合适的方法，提高PCT多克隆抗体检测PCT的灵敏度，以到达临床所需标准。本研究通过基?

【共引文献】