ENU化学诱变遗传模型构建与T淋巴细胞发育研究

发布时间：2020-01-29 03:29

【摘要】：背景ENU化学诱变是正向遗传学中最经典高效的方式,是识别新基因并用以解析哺乳动物免疫系统分子基础的强有力工具。T细胞作为机体适应性免疫的主要细胞群,承担着辅助机体抵抗病原体入侵、防御感染的重要作用。CD4蛋白是T细胞活化的共受体,结构性研究已说明T细胞表面存在着CD4的四个胞外域,其中就包括与MHCII配体相连的第一个胞外域。但是关于活体模型中CD4胞外域与MHCII的联系发生机制,目前尚没有明确的研究和报道。目的利用ENU诱变在常用近交系小鼠C57BL/6J品系中建立免疫缺陷小鼠模型,探究得到的CD4辅助T淋巴细胞完全缺失表型的分子机制,在活体中研究CD4第一个胞外域的关键作用,以期建立研究CD4 T细胞的最佳小鼠模型。方法1.以近交系小鼠的典型代表C57BL/6J品系作为基因诱变的对象。选取8周龄的C57BL/6J雄鼠30只进行腹腔ENU注射诱变,注射剂量为90mg/kg体重,按照每周一次的注射方式,连续注射三次。待经过诱变处理的雄鼠度过不育期,长至15周龄时,与野生型C57BL/6J雌鼠1:1进行合笼交配,作为G0构建加系。待生产的同一窝G1在哺育期结束后进行雌雄交配得到G2,再将同一窝生产的G2交配最终得到带有纯合突变的G3,即后续进行表型分析的活体对象。2.利用眼内眦静脉采血法取G3代小鼠抗凝血约100μl,取30μl血样与10μl抗体mix在流式管中混匀,冰上孵育30min;向其中加入400μl用蒸馏水与10xBD FACS裂解液稀释成的1x裂解液,室温避光孵育10min以裂解红细胞;流式上样分析。3.设计突变的Cd4基因序列,利用限制性内切酶克隆到哺乳动物表达载体PCI-Neo,得到瞬转质粒:pCI-mCD4。将与Cd4基因共表达的T2A-EGFP片段克隆到同样的酶切位点,得到最终的转染质粒pCI-mCD4-EGFP。4.将质粒及对照分别导入人HEK 293T细胞,转染24小时后在荧光显微镜下查看转染情况,并进行流式荧光检测。5.取CD3e敲除(CD3-/-)的小鼠作为受体对照,用磁珠试剂盒将Ly5.1Foxp3-eGFP供体小鼠脾脏和淋巴结中的CD4 T细胞纯化出来,分别球后注射入对照和突变小鼠。过继转移6周后,取受体鼠血样和脾脏淋巴结细胞进行流式分析,检测T细胞和调节T细胞的比例和变化情况。结果1.得到CD4 T细胞缺失的突变家系:在G3代小鼠血液样品中,CD4 T细胞完全缺失,而其它淋巴细胞的比例分布正常。将有表型突变小鼠与野生小鼠杂交得到CD4 T细胞比例正常的子代,且G3子代符合孟德尔遗传定律,此突变为常染色体的性遗传。2.通过外显子捕获和下一代基因测序技术,确认导致CD4 T细胞完全缺失是位于6号染色体上的Cd4基因124873055位T→A的点突变,导致编码区第99位氨基酸发生由异亮氨酸到天冬酰胺的错义突变。3.此CD4缺失突变模型使Cd4完全丧失了在T细胞发育中的作用,造成CD4 T淋巴细胞完全缺失。4.CD4第99位氨基酸由异亮氨酸到天冬酰胺的突变不影响CD4蛋白在细胞表面的表达。5.C57BL/6J背景下,ENU诱变得到CD4T细胞缺失的小鼠可作为包括过继转移实验在内研究CD4 T细胞的理想模式动物。结论ENU诱变导致C57BL/6J品系小鼠6号染色体Cd4基因124873055位碱基发生T→A的点突变,致使CD4第99位氨基酸由异亮氨酸突变为天冬酰胺,得到CD4辅助T细胞完全缺失的小鼠模型,此突变小鼠可作为过继转移实验研究CD4 T细胞的最佳模型。
【图文】：

图 1 ENU 诱变家系构建示意图型分析、留取鼠尾：对 8 周龄的 G3 代小鼠打耳标标记，从眼.5ml 抗凝静脉管中，上下颠倒混匀，标记耳标号。同时 1.5ml EP 管中，标记后置-20℃短暂保存以备提取 DNA箱；：将要标记的抗体按照稀释倍数混合为 mix，每个流式血样轻微离心至管底，涡旋震荡混匀，即刻取 30μl 样品冰上避光孵育 30min；理：将 FACS lysing solution 与蒸馏水按照 1:9 的比例配样品中加入 400μl，涡旋震荡，室温避光裂解 10min；：将处理好的样品涡旋振荡，用 BD FACS Canto 上样因定位

图 2 转染试剂示意图表 3 转染试剂及质粒配比XA MIXB2 3 1 125μl 0 Opti-MEM: 125μl 15μl 0 DNA(2500ng): 2.9μl 2P300: 5μl mixB 加入到 mixA 中，室温静置孵育 15-20min入到对应细胞培养孔中；养基，加入新鲜 DMEM 培养基各 1.8ml；荧光显微镜查看转染情况并流式分析。集到 1.5ml 离心管中，，标记；min，吸弃上清；
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 韩晓枫,马宝骊,张继英,王利,柏峻;胶原诱导性关节炎大鼠淋巴细胞的过继转移[J];免疫学杂志;2002年01期

2 丁兰，朱振齐，罗贵民，孙启安，杨同书，沈家骢;化学诱变抗体模拟谷胱甘肽过氧化物酶[J];生物化学杂志;1994年03期

3 张程亮;向明;邹晓蕾;彭佳蓓;;髓源性树突状细胞过继转移诱导1型糖尿病小鼠免疫耐受及其机制[J];世界华人消化杂志;2006年33期

4 段连宁,李树浓;T淋巴细胞表达杀伤细胞抑制性受体的研究进展[J];中国病理生理杂志;2002年08期

5 张华昌;范小平;向学熔;杨明聪;;复发性阿弗他溃疡患者的T淋巴细胞免疫因素的研究[J];重庆医学;2010年10期

6 季阳,黄如欣,秦占芬,曹凤,贾桂芳,马京香,何智,金振良,倪平安,张建华;中国6省区献血者人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ、Ⅱ型抗体血清流行病学调查[J];中华传染病杂志;2000年04期

7 赵明峰,邵宗鸿;T淋巴细胞与阵发性睡眠性血红蛋白尿症发病关系的研究现状[J];中华血液学杂志;2002年11期

8 任自力 ,周平 ,朱晓玲;慢性阻塞性肺疾病虚实证型与T淋巴细胞关系探讨[J];浙江中医杂志;2002年06期

9 段连宁,李江琪,杜江,潘兴华,郭坤元;优势化Ⅱ型T淋巴细胞表达杀伤细胞抑制性受体的初步观察[J];细胞与分子免疫学杂志;2004年01期

10 徐洪军,徐永根,严向明,朱锦祥;体外循环心内直视手术对小儿T淋巴细胞免疫功能的影响[J];江苏医药;2004年02期

相关会议论文 前10条

1 朱平;;异基因造血干细胞移植后优势增殖T淋巴细胞的分析[A];第一届全国难治性淋巴瘤学术研讨会暨第二届全国多发性骨髓瘤学术研讨会（国家级血液系统恶性肿瘤继续医学教育学习班）继续教育集[C];2007年

2 ;异基因造血干细胞移植后优势增殖T淋巴细胞的分析[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年

3 陆晓茜;刘霆;孟文彤;朱焕玲;席亚明;刘咏梅;;人骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年

4 胡晓梅;许勇钢;全日城;杨晓红;王洪志;徐述;郭小青;刘池;郑春梅;张姗姗;肖海燕;唐旭东;李柳;刘锋;麻柔;;骨髓增生异常综合征T淋巴细胞异常与克隆造血[A];全国中西医结合血液学学术会议论文汇编[C];2010年

5 陈灿;徐庆国;李海林;彭波;伍旭东;;化学诱变对水稻生理特性的影响[A];中国作物学会2007年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2007年

6 叶均安;施明华;陈能品;郭勇;;中草药饲料添加剂对肉鸡T淋巴细胞免疫效应的影响[A];第三届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];1998年

7 陈灿;黄璜;徐庆国;郭伟;李海林;彭波;;化学诱变对水稻叶绿素相对含量及叶绿素荧光参数的影响[A];中国遗传学会第十届全国激光生物学学术会议论文摘要集[C];2009年

8 张朝霞;王天有;;儿童特发性血小板减少性紫癜T淋巴细胞功能研究[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

9 梁秋丽;施焕中;邓静敏;覃雪军;梁象东;;吸入性变应原和口服糖皮质激素对过敏性支气管哮喘患者血清可溶性细胞毒T淋巴细胞相关粒原的影响[A];中华医学会第五次全国哮喘学术会议暨中国哮喘联盟第一次大会论文汇编[C];2006年

10 裘影影;李晶;殷玉俊;汤郁;尤海燕;;骨髓源间充质干细胞联合来氟米特对异基因小鼠T淋巴细胞的免疫调节作用[A];第十二届全国风湿病学学术会议论文集[C];2007年

相关博士学位论文 前5条

1 包宇实;前列腺素E_2对T淋巴细胞的免疫调节作用以及对异基因造血干细胞移植小鼠急性移植物抗宿主病的影响[D];中国协和医科大学;2008年

2 郭春辉;失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用[D];苏州大学;2015年

3 于铁成;关于低能冲击波对T淋巴细胞的作用及其作用机理的探讨[D];吉林大学;2004年

4 陈一鸣;T淋巴细胞识别自体慢性髓系白血病细胞肿瘤抗原的研究[D];中国协和医科大学;1996年

5 王真;晚期糖基化终产物促星形胶质细胞衰老机理及衰老小鼠脾脏T淋巴细胞的凋亡抗性[D];中国协和医科大学;2002年

相关硕士学位论文 前10条

1 王慧杰;ENU化学诱变遗传模型构建与T淋巴细胞发育研究[D];新乡医学院;2017年

2 智蕴涛;过继转移EAU的光学相干断层扫描表现[D];天津医科大学;2016年

3 马小亮;过继转移日本血吸虫感染鼠DC亚群对OVA诱导的哮喘鼠肺脏炎症抑制作用的实验研究[D];天津医科大学;2013年

4 王松;微拟球藻化学诱变及富油藻株的高通量筛选研究[D];中国海洋大学;2015年

5 祁伟;红掌离体化学诱变技术的研究[D];苏州大学;2016年

6 申妍姣;过继转移日本血吸虫感染鼠树突状细胞亚群对哮喘抑制作用的实验研究[D];天津医科大学;2012年

7 黎秋菊;异烟肼对大鼠T淋巴细胞、NK细胞及巨噬细胞功能影响的研究[D];四川医科大学;2015年

8 易丹;慢性乙型肝炎患者HBV不同基因型肝组织内T淋巴细胞表达的研究[D];桂林医学院;2015年

9 刘伟;颅内T淋巴细胞在脑出血后的变化规律及姜黄素的干预作用[D];第三军医大学;2016年

10 陈苓苓;探讨过继转移日本血吸虫感染鼠树突状细胞通过对白介素-13的调控而抑制过敏性哮喘黏液分泌的作用机制[D];天津医科大学;2017年

本文编号：2574227