类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1395的重组表达及生物学活性研究

发布时间：2020-03-01 11:32

【摘要】：目的类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallei,简称类鼻疽杆菌)作为一种正在扩散的人兽共患传染病病原菌,能够导致称为类鼻疽(melioidosis)的热带医学疾病,病死率高达40%。由于类鼻疽杆菌可在人体潜伏数十年后发病,故类鼻疽也被称为“不定时炸弹”。细菌分泌系统在其致病中发挥着关键的作用,包括Ⅲ型分泌系统(type three secretion system,T3SS)。BPSS1395基因定位于类鼻疽杆菌的T3SS,目前功能未知。通过生物信息学和BLAST比对发现与之同源性较高的蛋白是青枯杆菌的重要转录调节因子HrpF(hypersentive response and pathogenicity F),属于其T3SS效应蛋白。我们推测BPSS1395可能是类鼻疽杆菌T3SS的转运和定向元件。因此,本研究拟通过基因工程技术重组表达具有生物活性的BPSS1395蛋白并制备其抗体,确定其亚细胞定位;同时,构建类鼻疽杆菌BPSS1395基因敲除株,通过感染番茄植株证实BPSS1395在类鼻疽杆菌感染植物中的重要作用。以上实验将为深入研究类鼻疽杆菌作为一种潜在的植物病原造成人的感染和传播作用机制奠定基础。方法1.采用PCR扩增类鼻疽杆菌BPSS1395基因,目的基因与p ET-22b载体质粒通过Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切,酶切产物经回收、连接后转化Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞,获得阳性重组子,经双酶切和DNA测序验证。2.筛选得到的阳性工程菌经IPTG诱导表达目的蛋白并鉴定其表达形式,洗涤BPSS1395蛋白包涵体,通过复性得到可溶的BPSS1395蛋白。3.以复性BPSS1395蛋白免疫家兔,制备抗BPSS1395血清;Western blot、ELISA及免疫荧光分析其免疫学性质。4.通过超速离心机分离全菌各组分,Western blot分析BPSS1395蛋白的亚细胞定位。5.利用同源重组技术构建类鼻疽杆菌BPSS1395基因敲除菌株:PCR扩增类鼻疽杆菌BPSS1395基因上下游同源臂,连接至p K18mobSac B自杀质粒上,通过大肠杆菌S17-1λpir以接合方式将其转入类鼻疽杆菌中,而后蔗糖筛选获得基因敲除突变菌株,PCR、DNA测序鉴定敲除菌株。6.类鼻疽杆菌野生株、BPSS1395基因敲除菌株和EHEC O157:H7对照组分别感染番茄植株根部,观察植株及叶片的生长情况,PCR鉴定植物基因组中的细菌,电镜观察植株叶片病理学变化。结果:1.PCR获得了全长870bp BPSS1395目的基因,构建了表达重组质粒的阳性工程菌pET-22b-BPSS1395/BL21(DE3)。2.阳性工程菌经IPTG诱导表达,包涵体洗涤、复性获得了分子量为32k Da BPSS1395重组蛋白。3.该蛋白免疫家兔抗血清ELISA效价达1:1280000,并能与目的蛋白及类鼻疽杆菌全菌发生特异性抗原抗体反应。4.BPSS1395蛋白在类鼻疽杆菌中主要定位于细胞质。5.成功构建了类鼻疽杆菌BPSS1395基因敲除突变菌株。6.类鼻疽杆菌野生株和BPSS1395基因敲除株分别感染番茄植株后,虽然野生株与敲除株感染后叶片未见明显变化,但是电镜观察发现野生型感染组植物叶片的组织结构中有类鼻疽杆菌存在,同时PCR扩增出特异性类鼻疽杆菌基因,而敲除株感染组没有。结论:本课题采用基因工程技术重组表达了具有生物活性的BPSS1395蛋白,并确定了其亚细胞定位;制备了BPSS1395多克隆抗体,为研究该细菌及其蛋白的功能提供了有效工具;利用同源重组技术构建了BPSS1395基因敲除菌株,通过感染番茄植株证实了BPSS1395在类鼻疽杆菌感染植物中的重要作用。以上研究对深入研究类鼻疽杆菌作为一种潜在的植物病原造成人的感染和传播作用机制以及类鼻疽杆菌的防治具有重要的理论指导意义。
【图文】：

基因扩增,琼脂糖凝胶电泳,大肠埃希菌,相对分子量

DNA 相对分子量；1：BPSS1395 基因扩增产图 1 BPSS1395 基因扩增的琼脂糖凝胶电泳 pET-22b-BPSS1395 的酶切鉴定-BPSS1395 转化入大肠埃希菌 DH5α，得到约为 870bp 的目的片段及载体质目的基因 DNA 测序，结果见附录一致。

酶切鉴定,重组质粒

对分子量；1 和 2：pET-22b 空质粒和质粒 pET-22b-BPⅠ/XhoⅠ双酶切产物；3：BPSS1395 的 PCR 产物图 2 pET-22b-BPSS1395 重组质粒的酶切鉴定BPSS1395 的制备 BPSS1395 的诱导表达及表达形式鉴定菌经摇瓶培养，在 OD600达到 0.6-0.8 时加入 IP6h、5h、3h。从图 3 SDS-PAGE 电泳结果可以看2kDa 位置均增加了一条蛋白条带，与 BPSS1395软件分析发现：诱导温度在 16℃、25℃和 37℃表 4）。从超声破碎后的上清和沉淀的 SDS-P诱导后菌液的上清几乎没有目的蛋白，，而大果说明了表达的重组蛋白主要是以包涵体形
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78;R378

【参考文献】