加德纳菌糖苷水解酶的结构与功能研究

发布时间：2020-03-17 20:58

【摘要】：细菌性阴道病是一种严重困扰全球育龄期女性、影响生殖健康的疾病,它能造成包括HIV感染与传播、盆腔炎、宫颈癌、早产及尿道感染等多种疾病增加的风险。其中,加德纳菌在细菌性阴道病的发生发展过程中扮演了重要角色。研究表明加德纳菌具备独特的毒力因子(如阴道溶血素、粘附因子和抗药外排系统),很可能是引发细菌性阴道病的“罪魁祸首”。作为一种条件致病菌,加德纳菌很可能最先定植于阴道上皮细胞并形成生物被膜,为其他厌氧致病菌的入侵提供了类似于“脚手架”的作用,从而形成了一个由多菌群共存的生物被膜系统。正因为生物被膜的存在导致了细菌性阴道病以其顽固性、反复发作、难以根治的特点而著称。另一方面,生物被膜中的细菌常常面临着营养匮乏的问题,而糖类作为主要能量来源不仅是绝大多数生物赖以生存的“食物”,而且也是构成生物被膜的主要成分(胞外多糖),因此研究生物被膜中细菌的糖苷水解酶对于了解生物被膜中细菌的能量代谢具有重要意义。然而目前对于加德纳菌糖苷水解酶的研究几乎是一片空白。ADP38981.1是一种来源于加德纳菌糖苷水解酶20家族(GH20)的蛋白,结构域预测显示它具有B-N-乙酰己糖胺酶的性质,很可能是一种动物病原菌的重要毒力因子;ADP38499.1是另一个来源于加德纳菌糖苷水解酶家族的蛋白,属于G5家族,结构域预测显示它很可能是一种在生物被膜形成过程中起粘附作用的蛋白,此外该蛋白还具有类溶菌酶的结构域,暗示它可能具有降解胞外多糖以提供碳源的功能。另外,通过PDB数据库比对,我们发现这些糖苷水解酶不仅没有相关结构,而且同数据库中已知结构的蛋白之间的同源性很低,更重要的是目前没有针对加德纳菌糖苷水解酶的相关研究,因此选择它们作为研究对象很有意义。本文利用分子生物学和结构生物学的方法,将上述两种糖苷水解酶分别进行了大肠杆菌异源表达纯化、晶体培养、X-ray衍射、酶学性质检测及体外降解生物被膜试验等分析,试图从分子水平和功能方面来了解相关蛋白的性质和致病机理,以期为后续寻找相关药物靶点提供理论基础。本论文相关研究如下:1.通过构建原核表达系统,我们分别获得了表达量大、纯度较高的相关蛋白;2.通过蛋白质晶体的培养与优化,我们得到了ADP38981.1的native蛋白质晶体和硒代蛋白质晶体,并在上海同步辐射中心收到了相应的晶体衍射数据,经处理后的native蛋白质晶体最高分辨率为3.2A;3.通过体外酶活实验和生物被膜降解试验,我们初步获知了 ADP38981.1和ADP38499.1的相关特性,包括一些酶学参数以及对biofilm的降解效果。本论文的不足之处在于:没有获得ADP38499.1的蛋白质晶体,并且由于ADP38981.1的蛋白质晶体的衍射质量并不是很好,导致我们未能获得高分辨率的蛋白结构。
【图文】：

１．１．２细菌性阴道病的当前治疗逡逑当前，临床上对于ＢＶ的治疗方法主要是抗生素法和益生菌法，其他方逡逑法例如噻菌体疗法尚在试验阶段ｈ５邋２°〃６１。图１－２列出了几种治疗ＢＶ的方法及逡逑各方法的特点。逡逑Ｍａｌｅ邋ｐａｒｔｎｅｒｓ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｄｏ邋ｎｏｔ邋ｈｅｌｐ邋ｍ逡逑Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｓｅｘ邋ｐａｒｔｎｅｒｓ逦■邋ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ邋ＢＶ邋ｕｉｔｂｉｎ邋ｔｈｅ邋ｆｅｍａｌｅｓ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ逡逑／逦逦邋Ｔｈｉｓ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｏｎｌｙ邋ｓｕｐｐｏｓｅｓ邋ｔｈｅ邋ｖａｇｉｎａｌ逡逑／邋ｆ邋？邋？逦？逦，逦ｐａｔｈｏｇｅｍｃ邋ａｎａｅｒｏｂｅｓ．邋Ａｃｉｄｉｆｅｆｓ邋ｆａｉｌｅｄ邋ｉｎ逡逑／逦Ｍａｍｔａｉｎｍｇ＼ａｇｕｉａｌｐＨ邋ａｔ邋４邋ｉ逦■邋ｔｒｅａｔｉｎｇ邋Ｂ＼＊邋Ｄｏｕｃｌｕｎｇ邋ｉｓ邋ａ邋ｌｕｍｌｉｎｇ邋ｆａｃｔｏｒ邋ｉｎ逡逑／逦／邋ｖ邋■＇邋逦逦逦邋逦ｔｈｉｓ邋ｔｈｅｒａｐｙ逡逑／邋／逦Ａｃｔｉｖ５？ｉ邋ｃｈａｒｃｏａｌ邋ｕｓａｇｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｌｅｓｓｅｎ逡逑ｔｈｅ邋ｐＨ邋ａｎｄ邋ｗｉｔｈ邋ａ邋ｌｏｓｓ邋ｏｆ邋３．１％邋ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ．逡逑／逦＼逦／／逦Ａｃｍ－ａｔｅｄ邋Ｃｈａｒｃｏａｌ逦＂邋Ｓｔｉｌｌ邋ｎｅｅｄ邋ａ邋ｌｏｔ邋ｏｆ邋ｓｔｕｄｙ邋ｔｏ邋ｕｓｅ邋ｆｏｒ邋ｃｌｉｎｉｃａｌ逡逑／邋Ｎｏｉｌ－逦＇ｒ邋ｒ邋ｉ邋

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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R378

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本文编号：2587695